本发明专利技术公开了一种检测口蹄疫病毒基因组ＲＮＡ的单细胞实时荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ方法。该方法利用显微注射仪分离感染口蹄疫病毒的单个细胞，裂解后即用荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ进行定量分析。显微注射仪的可视化操作能快速准确地分离单个细胞，与高灵敏度的荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ相结合可实现检测单个细胞内病毒基因组ＲＮＡ的量。该方法可用于在单细胞水平上研究病毒的复制及其与宿主细胞的关系，为病毒感染细胞生物学的深入研究提供一种新的方法。且分离与裂解细胞的技术具有广泛适用性，可直接应用于其它种类病毒感染的细胞或正常细胞的分离预处理，使得本发明专利技术的方法也能用于其它ＲＮＡ病毒基因组检测和正常细胞基因组复制及转录的分子机制研究。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测口蹄疫病毒基因组RNA的单细胞实时荧光定量 RT-PCR的方法，适用于在单细胞水平上研究口蹄疫病毒的复制，进而分析病毒 的急性感染与持续性感染的机理，探究在感染过程中病毒与宿主细胞的关系。
技术介绍
口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus: FMDV)属小RNA病毒科口蹄疫病毒属，其所在的RNA病毒科在医学和兽医学上具有重要地位，该病毒主要 引发偶蹄动物发生口蹄疫。基因组由一条正义的RNA链组成，约含8500个核 苷酸，其复制经由一条互补的负链RNA作为模板。病毒感染其敏感细胞系(如仓 鼠肾细胞系BHK-21或猪肾细胞系IB-RS-2)，宿主细胞会发生致细胞病变效应 (CPE),表现为细胞变圆，内细胞膜重排等。除急性感染外，口蹄疫病毒还能在动物和细胞中建立持续性感染。基于口蹄疫病毒基因组的特点，现已建立了许多相关的检测方法包括杂交实验(Verheyden, B, Lauwers, S, et al. Quantitative RT-PCR ELISA to determine the amount and ratio of positive- and negative- strand viral RNA synthesis and the effect of guanidine in poliovirus infected cells. J. Pharm. Biomed. Anal, 2003, 33: 303-308.)、常规RT-PCR (Hofmann, MA， Thiir， B,et al. Rescue of infectious classical swine fever and foot-and-mouth disease virus by RNA transfection and virus detection by RT-PCR after extended storage of samples in Trizol. J. Virol. Methods, 2000, 87: 29-39.)以及近年建立的实时荧光定量RT-PCR(King, DP, Ferris, NP, et al. Detection of foot-and-mouth disease virus: comparative diagnostic sensitivity of two independent real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. J. Vet Diagn. Invest" 2006, 18: 93-97; Horsington, J, Zhang, Z. Analysis of foot-and-mouth disease vims replication using strand-specific quantitative RT-PCR. J. Virol. Methods, 2007, 144: 149-155.)。与其他的检测方法相比，荧光定量RT-PCR技术优势明显，如灵敏度高、速度快、特异性强，可减少交叉污染等。然而所有的这些 检测方法都是基于群体细胞的检测(组织块或细胞系)，所获得是群体细胞中病 毒复制的数据，只能反映群体细胞中的病毒量而不能获悉单个细胞中病毒的感染 及其复制情况。从上个世纪80年代末，生物学家们开始探索单细胞PCR和单细胞RT-PCR的 可行性。1988年，Jeffrey等从单个人体细胞中扩增出了微卫星DNA，标志着单细 胞PCR技术的建立(Jeffreys, AJ， Wilson, V， et al. Amplification of human minisatellites by the polymerase chain reaction: towards DNA fingerprinting of single cells.Nucleic. Acids. Res.， 1988， 16: 10953-10971.)。近几年荧光定量PCR技术又 被成功的用于检测单个神经元细胞中的基因以及研究胚胎发育细胞(Rice， JE, Sanchez, JA, et al. Real-time PCR with molecular beacons provides a highly accurate assay for detection of Tay-Sachs alleles in single cells. Prenat. Diagn., 2002, 22: 1130-1134; Pierce, KE, Rice, JE, et al. Detection of cystic fibrosis alleles from single cells using molecular beacons and a novel method of asymmetric real-time PCR, Mol. Hum. Reprod.， 2003, 9: 815-820)等。Wagatsuma等(Wagatsuma, A, Sadamoto, H， et al. Determination of the exact copy numbers of particular mRNAs in a single cell by quantitative real-time RT-PCR. J. Exp. Biol" 2005, 208: 2389-2398.)利用 实时荧光定量RT-PCR技术检测单个蛇脑巨细胞中环AMP应答元件结合蛋白(英 文名称CREB)的量，成功解决单细胞RT-PCR的两大难题。首先，他们用激光 切割术分离体细胞后用膜片钳吸液术将细胞内含物吸出，并成功地从单个细胞中 提出mRNAs;其次，选用高灵敏度的荧光定量RT-PCR技术代替核酸杂交和竞争 性PCR进行基因检测，能够检测微量的目标基因，特别适合于单细胞的定量分析。 但是其分离单细胞技术存在一定的问题，因为膜片钳技术不能保证完全能把细胞 内含物吸出而激光切割术也不能避免周围其他非巨细胞的污染。Parhar等(Parhar, IS, Ogawa, S, et al. Single-cell real-time quantitative polymerase chain reaction of immunofluorescently identified neurons of gonadotropin陽releasing hormone subtypes in cichlid fish. Endocrinology, 2003, 144: 3297-3300)利用实时荧光定量方法同时检测单个鱼神经元细胞中的促性腺激素释放激素的三个亚型首先他们用连接 在荧光显微镜上的显微操纵仪分离单个神经元细胞，利用负压将单个细胞转入装有50nl细胞裂解液的1.5ml离心管中，冻入-8(TC;再将分离出来的单细胞样品进 行蛋白消化和Dnase I酶解，用ISOGEN和RNA提取试剂盒提本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测口蹄疫病毒基因组ＲＮＡ的单细胞实时荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ方法，其步骤是： Ａ、单细胞的分离与裂解： ａ、病毒感染：用５０～１００ＰＦＵ滴度的口蹄疫病毒感染单层ＢＨＫ－２１细胞，１８～３６ｈ后，用胰酶将细胞消化，加入６～１０倍于胰酶量的新鲜ＭＥＭ生长培养基灭活胰酶，分散细胞，调整细胞浓度至１０↑［４］～１０↑［６］个／ｍｌ，最后，取１ｍｌ细胞悬液于直径６ｃｍ的无菌培养皿中，进行单细胞分离； ｂ、分离单细胞： 分离单细胞采用：ａ）拉针器，ｂ）磨针仪，ｃ）显微注射仪，ｄ）细胞储液，用拉针器和磨针仪制作细胞挑针，通过与显微注射仪连接的倒置显微镜直接观察待分离的细胞并能随时监控整个分离挑取单细胞的过程，用细胞挑针挑起单细胞后，直接提起伸入ＰＣＲ管液面下，完成将单细胞送入ＰＣＲ管内的细胞储液全过程； ｃ、细胞裂解： 每３０～６０ｍｉｎ处理单细胞样品，单细胞样品于９４℃～９８℃热变性２～８ｍｉｎ后，浸入液氮中，用蛋白酶Ｋ于５３℃酶解４０－７５ｍｉｎ，随后冻入液氮中直至进行荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ反应； Ｂ、荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ：一步法荧光定量反应液，反应总体积是５０μｌ，２×ｂｕｆｆｅｒ２５μｌ，正义引物ＦＰ和反义引物ＲＴ各２μｌ，２５μｍｏｌ／Ｌ的荧光探针０．５μｌ，反转录和热启动Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶１μｌ，ＲＮＡ酶抑制剂１μｌ，牛血清蛋白０．５μｌ，标准品或待测的单细胞样品５μｌ，无ＲＮａｓｅ的灭菌双蒸水１３μｌ组成，荧光探针５’端标记的荧光报告基团是ＦＡＭ，３’端标记荧光淬灭基团ＴＡＭＲＡ； 反应条件如下： ｃＤＮＡ合成： ５０℃ ３０ｍｉｎ ＰＣＲ： ９５℃ ５ｍｉｎ ＊＊＊ 细胞总ＲＮＡ的提取，将感染口蹄疫病毒１８～３６ｈ后的ＢＨＫ－２１细胞离心收集，加入裂解液４００μｌ混匀，室温静置１０ｍｉｎ，加８０μｌ氯仿，室温静置３ｍｉｎ，于４℃１２０００ｇ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，上清液转移到另一个离心管内，加２００μｌ异丙醇，室温沉淀１０ｍｉｎ，４℃１２０００ｇ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃上清，加１ｍｌ ７５％乙醇充分洗涤沉淀，于４℃７５００ｇ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃上清，沉淀ＲＮＡ并在室温下自然干燥，加无ＲＮａｓｅ水１０μｌ于６０℃ １０ｍｉｎ溶解，放入－７０℃保存； 取４～８个不同稀释度的标准品，１～２个细胞总ＲＮＡ作为阳性对照，２～４个阴性对照按照前面所列出的配制反应液，进行荧光定量ＰＣＲ反应。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郑从义，黄璇，李勇，屈三甫，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]
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