将预定改变引入有核细胞基因组的靶序列中的方法技术

技术编号:1733581 阅读:182 留言:0更新日期:2012-04-11 18:40
本发明专利技术涉及多核苷酸,它的第一链含有核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸两种,而第二链仅含有脱氧核糖核苷酸;其中链是沃森-克里克规则配对的并且通过寡核苷酸连接,如此该多核苷酸至多具有一个单一3'末端和一个单一5'末端。可将这些末端连接,这样多核苷酸就成为一个单一连续环状聚合物(single continuous circular polymer)。该多核苷酸可用于向靶基因中引入特定改变。(*该技术在2018年保护过期,可自由使用*)

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本申请是申请号为94194935.4,申请日为1994年12月9日,专利技术名称为“用于真核细胞中定点突变的化合物”的专利技术专利申请的分案申请。本申请是于1993年12月9日递交的第08/164303号专利申请的后续申请,后者全文引入本文以供参考。1.专利
本专利技术涉及分子遗传学领域。具体地说它涉及向活的、培养的真核细胞中引入特定基因改变的核酸化合物及其应用。更具体地说,它主要涉及基本上沃森-克里克规则配对的双链核酸,其中双链中的一条链的部分包含含2′-O或2′-OMe核糖的核苷酸,剩余部分包含脱氧核糖核苷酸。2.专利技术背景2.1.嵌合和/或杂种双链核酸本专利
涉及核酸。核酸是杂聚物,即不同亚单位的聚合物,亚单位是通过定向的磷酸二酯键或其衍生物连接形成聚合物。双链核酸是这样的核酸,按照尿嘧啶或胸腺嘧啶与腺嘌呤对应和胞嘧啶与鸟嘌呤对应的原则,双链中第一链的每一碱基对应于第二链的碱基。据说拥有这种对应性的逆平行双链是沃森-克里克规则配对的。双链核酸可有两种主要类型核糖核酸和脱氧核糖核酸。每种核糖核苷酸都有相应的脱氧核糖核苷酸,例如,腺嘌呤和脱氧腺嘌呤,胞嘧啶和脱氧胞嘧啶,鸟嘌呤和脱氧鸟嘌呤,尿嘧啶和胸腺嘧啶。如本领域中所用的那样,在同一链中存在核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的核酸被称为混合或嵌合(下文称“嵌合”)核酸。其中脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸相互对应的双链核酸被称为杂种双链(hybrid-duplex)。当两条链形成少于其全部碱基的双链核酸区时,所形成的分子被称为异形双链(heteroduplex)。更经常地,双链核酸的两条链是非共价键合的,而仅通过沃森-克里克规则配对相连。然而,双链的两条链可通过寡核苷酸连接形成单一聚合物(single polymer)。连接寡核苷酸不是沃森-克里克规则配对的。其中第一链和第二链是单一聚合物的部分的异形双链被称为“发夹双链”或“柱和环”结构。本文采用前一种名称。本文所用嵌合现象是核酸聚合物的一种特性,而杂种现象则是双链的一种特性。例如,mRNA及其模板形成杂种双链,但二者都是非嵌合的,然而例如嵌合的八核苷酸5′d(TTTT)-r(CCCC)3′和5′r(GGGG)-d(AAAA)3′相互形成沃森-克里克规则双链,但生成的双链是非杂种双链。下文称非杂种双链的双链核酸为“同质双链”(homo-duplex)。除非另外特别说明,同质双链仅指包含脱氧核苷酸的双链。最后,值得注意的是本领域中称沃森-克里克规则双链的形成为“杂交(hybridigation)”,即使其形成的是非杂种双链核酸。对X射线衍射和二维NMR分析嵌合和/或杂种核酸结构的研究感兴趣的人们已合成了用于此研究的嵌合核酸和杂种双链核酸。参见,例如Salazar,M。等,1994,J.Mol.Biol.241:440-55和Egli,M.等,1993,Biochemistry 32:3221-37(r3d7.d10形式的双链的嵌合杂种双链);Ban,C.等,1994,J.Mol.Biol.236:275-85(d5r1d4形式的自身互补嵌合杂种双链);Chou,S.H.,1991,Biochemistry 30:5248-57(d4r4d4形式的自身互补和非自身互补的嵌合杂种双链)。这些双链核酸的互补链彼此是非共价键合的;它们仅通过沃森-克里克规则配对相连。合成了嵌合核酸的第二组科学家感兴趣于核糖酶(ribozyme)的研究和用途,核糖酶即自身切开或切开其它RNA的RNA分子。Perreault,J.P.等,1990,Nature 344:565;Taylor,N.R.等,1992,Neucleic Acids Research20:4559-65;Shimaya,T.,1993,Nrucleic Acids Research 21:2605。这些研究发现嵌合核糖酶具有活性,并且对核酸酶的消化比RNA核糖酶具有更强的耐受性。嵌合核糖酶是自身互补的,即沃森-克里克规则配对链是共价连接的。在嵌合核糖酶的研究期间合成的化合物不同于上面提到的杂种双链分子,它们被合成用于结构的研究,因为其中的嵌合核糖酶不包括稳定的杂种双链。因而,具有DNA结合臂的嵌合核糖酶与其底物结合,并形成杂种双链。Yang,G.H.等,1990,Biochemistry 29:11156-60。还参见Sawata,S.等,1993,Neucleic Acids Research 21:5656-60;Hendry,P等,1992,Neucleic Acids Research 20:5737-41;Shimayama,T.,1993,Neucleic Acids Research 21:2605。核糖酶催化RNA底物的切开,杂种双链因此溶解。2.2.真核细胞中定点遗传改变分子生物学领域的技术人员知道不仅经常需要向靶真核细胞中引入新的多核酸序列,即新的基因,而且也需要对靶细胞中确定的预先存在的基因加以改变。靶细胞可在培养物中使用或者使用它建立转基因动物。已经建立了许多向培养的真核细胞中引入DNA的技术。这些技术包括磷酸钙沉淀法,DEAE-葡聚糖介导的胞吞作用,电穿孔,脂质体介导的融合,使用复制缺损病毒的转导作用。然而,这些技术虽然十分普遍地用于向真核细胞中引入功能性基因,但它们不能轻而易举地完成对特定存在基因的改变(突变)。引入之后,外源性DNA通过异常重组在细胞基因组中随机位点上分离,而不是通过同源重组在特定位点上分离。迄今为止,还没有一种令人普遍满意的向高级真核细胞,即哺乳动物或鸟类细胞中引入定点或特异位点的遗传改变(诱变)的方案。虽然在真核细胞中通过引入极长(>1kb)的核酸可获得同源重组,但这些技术需要应用复杂的筛选技术,因为在高级真核细胞中异常重组率大大超过了同源重组率。Thomas,K.R.&Smithies,M.R.,1987,Cell 52:503。还参见Valancius,V.&Smithies,O.,1991,Mol.Cell.Biol.11:4389(比较真核细胞中线性化和超螺旋质粒的同源重组)。一种完成优势定点诱变的方法是向细胞中直接引入单链寡脱氧核苷酸。这一技术被成功地用于酵母中,同源重组在啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中的活性显著高于真核细胞。Moreschell,R.P.等,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.85:524-28;Yamamoto,T.等,1992,Yeast 8:935-48并且,至今也没有用单链寡核苷酸成功地转化哺乳动物或鸟类细胞的报道。研究表明改变的嘌呤和嘧啶碱基区,即〔d(TG)30·d(AC)30〕显示显示了令人喜悦的重组率,由此可推知哺乳动物中靶DNA结构和同源重组率之间的关系。对培养的哺乳动物细胞的非复制质粒的研究证实了这些效果。Wahls,W.P.等,1990,Mol.Cell.Biol.10:785-93。这些实验没有进而表明外源性核酸和细胞基因组之间的重组。曾尝试使用RecA,一种促进细菌(大肠杆菌)中同源重组的蛋白质来促进真核细胞中的同源重组。但是,这些尝试显然未获得成功。例如,W.Bertling的美国专利本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种将预定改变引入有核细胞基因组的靶序列中的方法,它包括下述步骤:a.提供一种嵌合载体,它具有两个靶序列同源区,和一个排列在两个同源区之间的编码这种改变的异源区;b.使嵌合载体保持在细胞核中,以使嵌合载体与靶序列发生遗传学重组。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员:EB克米克
申请(专利权)人:托马斯杰弗逊大学
类型:发明
国别省市:US[美国]

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