基于高通量基因组测序的绵羊肉和鸭肉混合肉类成分的定量检测方法技术

本发明专利技术提供了一种混合肉类的定量检测方法，具体地，本发明专利技术提供了基于高通量基因组测序的绵羊肉和鸭肉混合肉类成分的定量检测方法，包括文库构建、测序、数据处理、结果判断等主要步骤。本发明专利技术提供的方法可用于高通量地定量检测多个绵羊-鸭混合肉类样品，有结果准确、检验快速、价格低廉等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物信息学和生物
，具体地，本专利技术提供了基于高通量基因 组测序的绵羊肉和鸭肉混合肉类成分的定量检测方法。
技术介绍
随着经济的发展和生活水平的提高，人们对肉类的需求日益增加，品种选择越来 越丰富。近年媒体曝光的"假羊肉"事件，在社会上引起了广泛的关注，由于绵羊肉脂肪 含量比较山羊高，吃起来更加细腻可口，不法商贩趁机在绵羊肉中添加价格低廉的鸭肉，冒 充优质绵羊肉，欺骗广大消费者。由于我国食品检测监督条件不完善W及技术水平和检测 成本的限制，使得"假羊肉"事件发生后，检测部口只能对样品渗假进行定性分析，而不能 给出鸭肉在羊肉中渗杂的比例的定量检测，无法依据混合的比例程度进行进一步的执法处 罚。当前，肉类混合样品的定量鉴定技术上，并没有一个可行的标准检测方法。基于英光定 量PCR方法理论上虽能准确鉴定肉样来源和混合比例，但是定量PCR技术重复性不佳，需要 熟练的技术人员，而且费用较高，通量比较低。因此，高效准确经济的鉴定肉类样品依然是 一个需要解决的难题。 因此，本领域迫切需要一种基于高通量测序技术平台开发的对绵羊肉和鸭肉的混 合成分进行定量检测的新方法。
技术实现思路
本专利技术的目的之一即在于提供一种基于高通量测序技术平台开发的一种绵羊肉 和鸭肉混合成分的物种定量检测新方法。 在本专利技术的第一方面，提供了 一种测定混合肉类的定量检测方法，包含W下步 骤： (a)提供一待测样品； 化）从所述样品中，提取全基因组DNA; (C)用上一步骤的全基因组DNA，构建PCR-化ee文库； (d)对上一步骤的PCR-化ee文库进行测序，从而获得所述待测样品的全基因组 DNA读序； (f)将所述读序与动物全基因组DNA标准序列进行比对，从而获得匹配的读序（即 比对上的读序）； (g)计算与所述动物物种全基因组DNA标准序列相匹配的匹配读序的碱基数总长 占总读序碱基数长度的百分比，即读序的比对率； 化）基于所述的读序比对率，根据制作的标准曲线计算所述待测样品中各动物源 性成分的含量。 在另一优选例中，在步骤化）中，通过与标准曲线的比较或通过拟合公式的计算， 得出所述待测样品中动物源性成分的含量。 在另一优选例中，在步骤化）中，所述的标准曲线包括二种或多种不同动物的全 基因组DNA的"读序比对率一质量含量百分比"标准曲线。[001引在另一优选例中，所述的标准曲线包括，绵羊和鸭的2种不同动物的全基因组DNA的"读序比对率一质量含量百分比"标准曲线。 在另一优选例中，所述的样本含有2种或多种肉类。 在另一优选例中，所述的肉类为鸭和绵羊的混合肉。 在另一优选例中，在步骤化）中，包括与绵羊的标准曲线进行比较或通过拟合公 式的计算，得出所述待测样品中绵羊肉的质量含量。 在另一优选例中，在步骤化）中，包括与鸭的标准曲线进行比较或通过拟合公式 的计算，得出所述待测样品中鸭肉的质量含量。 在另一优选例中，所述的绵羊的拟合公式如下式I所示： Y= 1. 1809X (I) 式中，Y为绵羊肉的质量百分比，按样本的总质量计算； 其中，X为混合肉样本中比对到绵羊染色体基因组的所有读长的碱基数之和/测 序中所有读长碱基数的总和； 和 / 或所述的鸭肉的拟合公式如下式II所示： Y' = 1.：M5X， (II) 式中，Y'为鸭肉的质量百分比，按样本的总质量计算； 其中，X'为混合肉样本中比对到鸭染色体基因组的所有读长的碱基数之和/测序 中所有读长碱基数的总和。 在另一优选例中，X'为1-90% ;较佳地为10-90%，更佳地为30-90%。 在另一优选例中，X为1-90% ;较佳地为10-90%，更佳地为30-90%。 在另一优选例中，在步骤化）中，按W下判断标准确定羊肉的含量：[003引 当X为《1%，羊肉的含量为0-1% ; 当X为1-10%，羊肉的含量为1-15% ; 当X为10-50 %，羊肉的含量为10-60 % ; 当X为50-80 %，羊肉的含量为50-95 % ; 当X为80-99 %，羊肉的含量为90-100 % ; 其中，X为比对到绵羊的读序的比对率；[003引 和/或 在步骤化）中，按W下判断标准确定鸭肉的含量： 当X，为《1%，鸭肉的含量为0-1.5% ; 当X'为1-10%，鸭肉的含量为1-15% ; 当X'为10-50%，鸭肉的含量为10-70% ;当X'为50-70 %，鸭肉的含量为60-95 % ; 当X'为70-99%，鸭肉的含量为90-100%。 其中，X'为比对到鸭的读序的比对率。 在另一优选例中，所述的样品选自：生的、熟制的、半熟制的、胳制的、熏制的、冷冻 和/或冷藏的肉类和/或水产样品，W及它们的组合；并且 所述的样品包含动物脏器和血制品。 在另一优选例中，所述方法还设置阳性对照组；并且， 所述阳性对照组的试验条件与测试组相同，不同点在于，所述阳性对照组中为成 分已知的单一肉类样品。 在另一优选例中，在步骤（C)中包括W下步骤： 先将所述的全基因组DNA打断为150-35化p(更佳地150-25化P)的片段，然后再 构建文库；和/或 对于所述的经处理的片段化DNA进行纯化，从而获得大小为200-3(K)bp(较佳地 240-260bp)的DNA片段。 在另一优选例中，在所述打断中，采用CovarisLE220打断仪进行打断。 在另一优选例中，在步骤（C)中，还包括对打断的片段化DNA，进行末端修复、连接 接头、和缺口平移处理。 在另一优选例中，在步骤（C)中，还包括在步骤（d)中，用选自下组的测序仪器进 行测序：IonProton?System,LifeTechnolo邑ies的proton或PGM,IlluminaHiSeq,ABI SOLiD,Roche454。 在另一优选例中，优选使用IonProton?System进行测序。 应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可W互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。【附图说明】 图1显示了本专利技术的一个优选例中绵羊肉拟合曲线。其中： X:为混合肉样本中比对到绵羊染色体基因组的所有读长的碱基数之和/测序中 所有读长碱基数的总和。 y:绵羊肉在混合肉中的质量比例 图2显示了本专利技术的一个优选例中鸭肉拟合曲线。其中： X:为混合肉样本中比对到鸭染色体基因组的所有读长的碱基数之和/测序中所 有读长碱基数的总和。 y:鸭肉在混合肉中的质量比例【具体实施方式】 专利技术人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现对于混合肉类（如绵羊和鸭的混 合肉），通过提取总DNA、打断、加接头，建立DNA小片段文库进行测序，所计算出的各自动物 的Ma卵ingrate(比对率）与所述混合肉类中各物种肉类的质量含量百分率之间存在良好 的线性关系，因此，可通过所述的比对率来定量测定所述混合肉类样品中相应肉类的质量 含量百分率。此外，本专利技术还提供了在DNA文库构建过程中，对于不同的样品连接不同的 barcode序列接头，从而对多样品可进行高通量的准确的定量检测。在此基础上完成了本发 明。[00财 读序比对率 该比对率为比对到某一物种基因组的读序的有效碱基数占总测序读序有效碱基 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定混合肉类的定量检测方法，其特征在于，包含以下步骤：(a)提供一待测样品；(b)从所述样品中，提取全基因组DNA；(c)用上一步骤的全基因组DNA，构建PCR‑free文库；(d)对上一步骤的PCR‑free文库进行测序，从而获得所述待测样品的全基因组DNA读序；(f)将所述读序与动物全基因组DNA标准序列进行比对，从而获得匹配的读序(即比对上的读序)；(g)计算与所述动物物种全基因组DNA标准序列相匹配的匹配读序的碱基数总长占总读序碱基数长度的百分比，即读序的比对率；(h)基于所述的读序比对率，根据制作的标准曲线计算所述待测样品中各动物源性成分的含量。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曾鹏，王磊，刘心，程时锋，黄佳颖，
申请(专利权)人：深圳华大基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44