用于在预选位点修饰植物基因组的方法和手段技术

提供了以靶向方式修饰棉花植物基因组的方法和手段，使用双链DNA断裂诱导酶和胚性愈伤组织。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于在预选位点修饰植物基因组的方法和手段专利
本专利技术涉及农艺学领域。更具体地，本专利技术提供了使用胚性愈伤组织在棉花植物的基因组中精确定位的核苷酸序列上引入靶向修饰的方法和手段，该靶向修饰包括插入、缺失或取代。
技术介绍
在植物基因组中引入靶向修饰的需求（包括控制在植物中外源DNA整合的定位）已变得日益重要，并且为了满足这一需求，已经开发了若干方法（综述参见Kumar（库马尔）和Fladung（弗拉东），2001,TrendsinPlantScience（《植物科学趋势》），6,pp155-159）。这些方法大部分依赖于经由双链断裂诱导（DSBI）酶的表达，在靶向位置初始引入的双链DNA断裂。经由罕见切割内切核酸酶（例如I-SceI），通过诱导双链DNA断裂（DSB），激活靶基因座和/或修复或供体DNA，已经示出出增加若干数量级的同源重组的频率（Puchta（普赫塔）等人，1996,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.（美国国家科学院院刊）），93,pp5055-5060;Chilton（奇尔顿）和Que（秋），PlantPhysiol.（《植物生理学》），2003;D’Halluin（阿吕安）等人，2008PlantBiotechnol.J.（《植物生物技术杂志》）6,93-102）。WO96/14408描述了一种编码酶I-SceI的分离DNA。这种DNA序列可以并入克隆和表达载体、转化细胞系和转基因动物中。在基因作图和基因的定点插入中这些载体可以是有用的。WO00/46386描述了通过I-SceI诱导的双链断裂，在细胞中修饰、修复、减弱和灭活一个基因或其他染色体DNA的方法。还披露了在需要其的个体中治疗或预防遗传性疾病的方法。进一步披露了嵌合的限制性内切酶。WO2005/049842描述了使用罕见分裂“双链断裂”诱导（DSBI）酶连同改进的I-SceI编码核苷酸序列改进植物中靶向DNA插入的方法和手段。WO2006/105946描述了用于通过同源重组在植物细胞和植物中将靶DNA序列精确交换为感兴趣的DNA序列的方法，由此可以随后去除在用于基因取代事件的临时选择的同源重组阶段期间使用的可选择的或可筛选的标记，而在去除步骤期间不遗留痕迹并且不依靠体外培养，采用其中描述的方法用于通过小孢子特异性表达的DSBI罕见分裂内切核酸酶去除选择的DNA。WO2008/037436描述了WO2006/105946方法和手段的变体，其中通过双链断裂诱导罕见分裂内切核酸酶诱导的选择的DNA片段的去除步骤处于种系特异启动子的控制下。该方法的其他实施例依赖在修复DNA的一端的非同源末端-连接和在另一端的同源重组。WO08/148559描述了WO2008/037436方法的变体，即在真核细胞中（例如植物细胞）中通过同源重组用于将靶DNA序列精确交换为感兴趣的DNA序列的方法，由此可以随后去除在用于基因取代事件的临时选择的同源重组阶段期间使用的可选择的或可筛选的标记，而不遗留痕迹,采用用于去除在直接重复中侧翼是两个核苷酸序列的选择的DNA的方法。WO2003/004659披露了重组系统以及用于从真核生物染色体DNA去除核酸序列的方法。本专利技术还涉及转基因生物（优选地植物），包含所述系统或由所述方法产生。WO2006/032426披露了改进的重组系统以及用于从植物基因组中消除标记序列的方法。具体地，本专利技术基于一种表达盒的用途，该表达盒包括欧芹泛素启动子，以及可操作地连接到其上的编码特异DNA-核酸内切酶序列的核酸序列。WO2009/006297披露了用于改变单子叶植物细胞和单子叶植物的基因组的方法和组合物，涉及使用双链断裂诱导剂以改变单子叶植物或植物细胞基因组序列，该序列包括用于双链断裂诱导剂的识别序列。WO2004/006667描述了经由体细胞胚发生的棉花的再生和农杆菌介导的转化的改进方法。WO2005/103271描述了经由农杆菌介导的T-DNA接合至悬浮液-培养的细胞或愈伤组织用于高效植物转化的方法，采用过滤器的膜作为用于T-DNA供体和受体的共培养的多孔固体支持物。WO2008/112633涉及外植体材料的切除，该外植体材料包括来自棉花种子的分生组织。披露了用于转化植物的组织制备、储存、转化和选择或鉴别的方法，以及由此种方法产生的可转化的分生组织和植物、以及用于组织制备的设备（apparati）。使用DSBI酶的基因组工程方法已经在植物，像烟草（参见例如Puchta（普赫塔）等人），1996;Townsend（汤森）等人，Nature（《自然》）459:442-445,2009）和玉米（参见例如WO2009/006297，Shukla（舒克拉）等人，Nature（《自然》）459:437-441,2009）中施用。然而，仍然存在对开发用于植物的靶向基因组修饰的方法的需求，这些植物在组织培养和转化中更顽固，例如棉花。本专利技术通过提供这种方法提供了一种本领域内的贡献，该方法使用棉花胚性愈伤组织用于单独或与一种修复DNA组合引入内切核酸酶，这一修复DNA将用作用于双链DNA断裂修复的模板。专利技术概述在第一实施例中，本专利技术提供了一种用于在预定义位点修饰棉花植物细胞基因组的方法，该方法包括以下步骤a.在所述预定义位点或其附近诱导双链DNA断裂，所述双链断裂是通过向所述细胞引入罕见分裂内切核酸酶诱导，该酶在所述预定义位点或其附近识别一个识别序列；b.选择一种植物细胞，其中所述双链DNA断裂已经被修复，导致了在基因组中所述预选位点的修饰，其中所述修饰选自i.至少一个核苷酸的取代；ii.至少一个核苷酸的缺失；iii.至少一个核苷酸的插入；或者iv.i.-iii.的任何组合；其特征在于所述细胞包括在胚性愈伤组织中在一个实施例中，可以通过将编码所述内切核酸酶的DNA分子递送至所述细胞中，将该内切核酸酶引入所述细胞。在另一个实施例中，先于步骤b.，将一种外源修复DNA分子递送至所述细胞中，所述外源修复DNA分子被用作用于修复所述双链DNA断裂的模板。在一个特定实施例中，该胚性愈伤组织诱导自下胚轴的外植体。胚性愈伤组织可以在包括活性炭的培养基上诱导。在所述内切核酸酶的所述引入之前、之中和之后，可以在没有激素的培养基中孵育胚性愈伤组织。在所述内切核酸酶的所述引入之前和之后，还可以在固体培养基上孵育愈伤组织。另外，在内切核酸酶的所述引入之中或之后，可以在非选择性培养基上孵育胚性愈伤组织1至4天。在一个实施例中，通过粒子轰击将内切核酸酶编码DNA和/或外源修复DNA递送至胚性愈伤组织的细胞中。可以用约0.5pmol外源修复DNA和/或约0.5pmol内切核酸酶编码DNA实施轰击。在轰击之前胚性愈伤组织可以在包括0.2M甘露醇和0.2M山梨醇的培养基中孵育约2至约20小时。另外，在所述内切核酸酶的所述引入之中或之后，可以在非选择性培养基（包括0.2M甘露醇）上孵育胚性愈伤组织1至4天。在一个实施例中，使用农杆菌介导的转化将内切核酸酶编码DNA和/或外源修复DNA递送至胚性愈伤组织的细胞中。可以通过将愈伤组织与一种或多种土壤农杆菌属菌株（包括这一种或多种DNA分子）在包括100μM乙酰丁香酮和/或100mg/lL-半胱氨酸的培养基中共培本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于在预定义位点修饰棉花植物细胞基因组的方法，该方法包括以下步骤a.在所述预定义位点或其附近诱导双链DNA断裂，所述双链断裂是通过向所述细胞引入罕见分裂内切核酸酶诱导的，该罕见分裂内切核酸酶在所述预定义位点或其附近识别一个识别序列；b.选择一种植物细胞，其中所述双链DNA断裂已经被修复，导致了在基因组中在所述预选位点的修饰，其中所述修饰选自i.至少一个核苷酸的取代；ii.至少一个核苷酸的缺失；iii.至少一个核苷酸的插入；或者iv.i.?iii.的任何组合；其特征在于所述细胞包括在胚性愈伤组织内。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.06.06 EP 11004570.5;2011.06.06 US 61/493,5791.一种用于在预定义位点修饰棉花植物细胞基因组的方法，该方法包括以下步骤a.在所述预定义位点或其附近诱导双链DNA断裂，所述双链断裂是通过向所述细胞引入罕见分裂内切核酸酶诱导的，该罕见分裂内切核酸酶在所述预定义位点或其附近识别一个识别序列；b.选择一种植物细胞，其中所述双链DNA断裂已经被修复，导致了在基因组中在所述预选位点的修饰，其中所述修饰选自i.至少一个核苷酸的取代；ii.至少一个核苷酸的缺失；iii.至少一个核苷酸的插入；或者iv.i.-iii.的任何组合；其特征在于所述细胞包括在脆弱胚性愈伤组织内，其中在包括活性炭的培养基上诱导所述脆弱胚性愈伤组织并维持在暗光条件下，其中所述暗光条件的光强度是1至7μmolm-2sec-1，光周期是16H光/8H黑暗。2.如权利要求1所述的方法，其中通过将编码所述内切核酸酶的DNA分子递送至所述细胞中，将所述内切核酸酶引入所述细胞。3.如权利要求1或2所述的方法，其中先于步骤b.，将一种外源修复DNA分子递送至所述细胞中，所述外源修复DNA分子被用作用于修复所述双链DNA断裂的模板。4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述胚性愈伤组织诱导自下胚轴外植体。5.如权利要求1或2所述的方法，其中在所述内切核酸酶的所述引入之前、之中和之后，将所述胚性愈伤组织在没有激素的培养基中进行孵育。6.如权利要求1或2所述的方法，其中在所述内切核酸酶的所述引入之前和之后，将所述胚性愈伤组织在固体培养基上进行孵育。7.如权利要求1或2所述的方法，其中在所述内切核酸酶的所述引入之中或之后，将所述胚性愈伤组织在非选择性培养基上孵育1至4天。8.如权利要求3所述的方法，其中所述DNA递送通过粒子轰击实施。9.如权利要求8所述的方法，其中所述轰击用0.5pmol外源修复DNA和/或0.5pmol内切核酸酶编码DNA实施。10.如权利要求8或9所述的方法，其中在轰击之前，所述胚性愈伤组织在包括0.2M甘露醇和0.2M山梨醇的培养基上孵育2至20小时。11.如权利要求8所述的方法，其中在所述内切核酸酶的所述引入之中或之后，将所述胚性愈伤组织在包括0.2M甘露醇的非选择性培养基上孵育1至4天。12.如权利要求3所述的方法，其中所述DNA递送使用农杆菌属实施。13.如权利要求12所述的方法，其中所述DNA递送通过在包括100μM乙酰...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·达伦，
申请(专利权)人：拜尔作物科学公司，
类型：
国别省市：