异转糖基酶及其用途制造技术

本发明专利技术涉及具有除了混合键β-葡聚糖:木葡聚糖内转葡糖基酶(MXE)活性之外的纤维素:木葡聚糖内转葡糖基酶(CXE)活性的异转糖基酶蛋白。该蛋白质可包含具有SEQ ID NO:2、6和8中任一个的氨基酸序列或其功能片段；或与SEQ ID NO:2、6和8的任一个或与SEQ ID NO:2的氨基酸22到280、与SEQ ID NO:6的氨基酸26到283、或与SEQ ID NO:8的氨基酸29到287具有至少60％序列一致性的氨基酸序列。此外，本发明专利技术涉及编码在此描述的蛋白质的分离的核酸、尤其是包含在此描述的核酸的嵌合基因、包含所述嵌合基因的载体、包含所述载体或所述嵌合基因的宿主细胞以及相应的转基因植物。在此进一步披露了产生转基因植物的方法和改进纤维素材料的特性的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及具有除了混合键β-葡聚糖:木葡聚糖内转葡糖基酶(MXE)活性之外的纤维素:木葡聚糖内转葡糖基酶(CXE)活性的异转糖基酶(HTG)蛋白。该蛋白质可包含具有SEQIDNO:2、6和8中任一个的氨基酸序列或其功能片段；或者该蛋白质可包含与SEQIDNO:2、6和8的任一个或与SEQIDNO:2的氨基酸22到280、与SEQIDNO:6的氨基酸26到283、或与SEQIDNO:8的氨基酸29到287具有至少60％序列一致性的氨基酸序列。此外，本专利技术涉及编码在此描述的蛋白质的分离的核酸、尤其是包含在此描述的核酸的嵌合基因、包含所述嵌合基因的载体、包含所述载体或所述嵌合基因的宿主细胞、以及包含所述嵌合基因的转基因植物。在此进一步披露的是产生转基因植物的方法和改变产纤维植物中的至少一种纤维特性或用于强化如权利要求书中表征的植物的方法。在本说明书中，引用了许多文件，包括专利申请和制造商手册。这些文献的披露内容，尽管认为与本专利技术的可专利性不相关，通过引用以其全文结合在此。更具体地，参考的全部文献通过引用的方式以相同的程度结合，如同专门且个别地指出通过引用的方式结合每份单独的文献。陆生植物的结构完整性大部分是由植物细胞周围的细胞壁介导的，细胞壁负责植物的强度和柔性。除了这种功能之外，植物细胞壁对于细胞间粘聚和细胞间通讯也是重要的。细胞壁孔隙率使水分和养分能够交换。维管植物的初生细胞壁由包埋在化学复合基质中的纤维素微纤丝组成，该化学复合基质由多糖组成，这些多糖主要如在双子叶植物和许多单子叶植物中的木葡聚糖和果胶多糖或主要在草类和谷物中的葡糖醛酸阿拉伯糖基木聚糖和(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖。虽然到目前为止已经阐明了植物细胞壁中多糖的类型和丰度，但是在细胞壁中的多糖之间的分子相互作用方面仅仅可得到很少的信息。广泛的分子间氢键而不是共价相互作用很久以来被认为负责将不同的多糖保持在适当位置(巴西克(Bacic)等人1988；萨默维尔(Somerville)等人2004)。专利技术背景已经发现木葡聚糖是细胞壁形态发生中的重要因子(综述于鲍曼(Baumann)等人，2007)，并且木葡聚糖能够与纤维素形成氢键，参考文献见《植物杂志》(ThePlantJournal)，1993，第1-30页。多糖转糖基酶，也称为多糖转聚糖酶，通过切割多糖链中的糖苷键并且将它们切割的部分转移到另一多糖或寡糖分子的非还原残基的羟基上而催化多糖分子的重组(由弗兰科娃(Franková)和弗赖伊(Fry)综述，2013；一并通过引用结合在此)。转糖基酶的实例是转葡糖基酶(也称为转葡聚糖酶)、转木聚糖酶和转甘露聚糖酶。在这些酶中，木葡聚糖内转葡糖基酶(XET；也称为木葡聚糖内转葡聚糖酶，或XTH或木葡聚糖木糖葡糖基转移酶)使包括木贼属和苔类在内的陆生植物的初生和次生细胞壁中的木葡聚糖重构(弗赖伊(Fry)等人，1992；弗赖伊等人，2008)。不像大多数其他测试的陆生植物，木贼属另外展现出被称为混合键β-葡聚糖:木葡聚糖内转葡糖基酶(MXE)(或混合键β-葡聚糖:木糖葡聚糖内转葡聚糖酶)的不同的内转葡糖基酶(或内转葡聚糖酶)。后者酶使用混合键(1,3；1,4)-β-葡聚糖(MLG)作为供体底物并且将它共价附接至木葡聚糖或或其片段(弗赖伊等人，2008)。到目前为止，已经发现但尚未详细表征催化异转糖基化(即，使用性质不同的供体和受体底物)的酶(艾特·莫翰德(AitMohand)和法尔卡什2006)，或者已经发现这些酶仅仅具有较小的异转糖基化活性(赫尔莫瓦(Hrmova)等人，参见下文)。已经显示，木葡聚糖共价连接至果胶多糖(汤普森(Thompson)和弗赖伊，2000)。在悬浮培养的玫瑰细胞中的木葡聚糖与酸性果胶之间的共价键的证据描述于阿布德尔·马西(Abdel-Massih)等人(2003)和卡明(Cumming)等人(2005，)。此外，赫尔莫瓦(Hrmova)等人已经示出，来自大麦的XET将MLG、羟乙基纤维素和硫酸溶胀的纤维素(即，硫酸纤维素)连接至木葡聚糖(赫尔莫瓦(Hrmova)等人2007)。在其将MLG连接至木葡聚糖的能力方面，这种大麦酶展现出MXE活性，然而，仅仅相当于其XET活性的约0.2％。本专利技术披露内容到目前为止，未曾描述将不溶性纤维素共价附接至木葡聚糖的转葡糖基酶活性。这种活性可在比如纺织品、纸张或木浆的纤维素材料的功能化中具有重要应用。相应地，在第一实施例中，本专利技术涉及具有纤维素:木葡聚糖内转葡糖基酶(CXE)活性的蛋白质。在一个实施例中，该蛋白质来源于木贼属，如溪木贼(Equisetumfluviatile)、木贼(Equisetumhyemale)、或披散木贼(Equisetumdiffusum)。在另一个实施例中，该蛋白质包括(a)具有SEQIDNO:2、6和8中任一个的氨基酸序列或其功能片段；或(b)与SEQIDNO:2、6和8的任一个的序列具有至少60％序列一致性的氨基酸序列；或(c)与SEQIDNO:2的氨基酸22到280的序列、与SEQIDNO:6的氨基酸26到283的序列、或与SEQIDNO:8的氨基酸29到287的序列具有至少60％序列一致性的氨基酸序列。除非另外指明，以下针对在此披露的某些方面而描述的实施例和实例也适用于在此披露的其他方面的对应实施例。如本文所用的术语“蛋白质”描述一组由多于30个氨基酸组成的分子，而术语“肽”描述由至多30个氨基酸组成的分子。蛋白质和肽可以进一步形成二聚体、三聚体和更高级的寡聚体，即由多于一个(多)肽分子组成。形成此类二聚体、三聚体等的蛋白质或肽分子可以相同或不相同。因此，相应的更高级的结构被称为同或异二聚体、同或异三聚体等。术语“蛋白质”和“肽”也指天然修饰的蛋白质或肽，其中修饰是例如通过糖基化、乙酰化、磷酸化等实现的。此类修饰在本领域中是熟知的。纤维素:木葡聚糖内转葡糖基酶(CXE)活性表示本专利技术的蛋白质催化葡聚糖(或纤维寡糖)单元从作为供体分子的纤维素转移到作为受体分子的木葡聚糖(或其寡糖)的活性。更具体地说，本专利技术的蛋白质切割纤维素链中的β-(1→4)-葡萄糖键，并且然后与作为受体底物的木葡聚糖聚合物或寡聚体的非还原残基再形成糖苷键。如在此本文使用的，术语“包含”应解释为指定所陈述的特征、整体、步骤、或部件的存在，但不排除存在或增加一个或多个特征、整体、步骤、部件或其组。因此，例如，包含核苷酸或氨基酸序列的核酸或蛋白质可以包含比实际引用的更多的核苷酸或氨基酸，即被嵌入在更大的核酸或蛋白质中或被附本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有纤维素:木葡聚糖内转葡糖基酶活性的蛋白质。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.09.24 EP 13185727.8;2013.11.08 EP 13192054.81.一种具有纤维素:木葡聚糖内转葡糖基酶活性的蛋白质。
2.如权利要求1所述的蛋白质，该蛋白质来源于木贼属。
3.如权利要求1或2所述的蛋白质，该蛋白质包含
(a)SEQIDNO:2、6和8中任一个的氨基酸序列或其功能片段；或
(b)与SEQIDNO:2、6和8中任一个的序列具有至少60％序列一致性的氨基酸序列，或
(c)与SEQIDNO:2的氨基酸22到280的序列、或与SEQIDNO:6的氨基酸26到283的序
列、或与SEQIDNO:8的氨基酸29到287的序列具有至少60％序列一致性的氨基酸序列。
4.如权利要求1到3中任一项所述的蛋白质，其中所述纤维素:木葡聚糖内转葡糖基酶
活性是该蛋白质的主要活性之一。
5.一种选自下组的分离的核酸，该组由以下各项组成：
(a)编码如权利要求1到4中任一项所述的蛋白质的核酸序列，
(b)与SEQIDNO:1、5和7中任一个的序列或其互补物具有至少60％序列一致性的核酸
序列；
(c)与SEQIDNO:1的核苷酸64到840的序列或其互补物、或与SEQIDNO:5的核苷酸76
到849的序列或其互补物、或与SEQIDNO:7的核苷酸85到861的序列或其互补物具有至少
60％序列一致性的核酸序列，和
(d)与SEQIDNO:1、5和7中任一个的序列或其互补物在高严格条件下杂交的的核酸序
列。
6.一种嵌合基因，该嵌合基因包含以下可操作连接的元件：
(a)启动子，该启动子优选可在植物中表达
(b)能够调节如权利要求1到4中任一项所述的蛋白质的表达的核酸，以及任选地，
(c)转录终止与聚腺苷酸化区。
7.如权利要求6所述的嵌合基因，其中所述能够调节如权利要求1到4中任一项所述的
蛋白质的表达的核酸包括如权利要求5所述的核酸。
8.如权利要求6或7所述的嵌合基因，其中所述启动子是组成型启动子、种子特异性启
动子、茎特异性启动子或纤维特异性启动子。
9.一种包含如权利要求6到8中任一项所述的嵌合基因的载体。
10.一种包含如权利要求6到8中任一项所述的嵌合基因或如权利要求9所述的载体的
宿主细胞。
11.如权利要求10所述的细胞，该细胞为植物细胞。
12.一种包含如权利要求6到8中任一项所述的嵌合基因或如权利要求9所述的载体或
如权利要求11所述的植物细胞的转基因植物、植物部分或种子。
13.如权利要求12所述的转基因植物，该转基因植物选自棉花、小麦、卡诺拉和其他油
菜、水稻、玉米、大豆、高粱、向日葵、烟草、甜菜、玉蜀黍、大麦、番茄、芒果、桃、苹果、梨、草
莓、香蕉、甜瓜、马铃薯、胡...

【专利技术属性】
技术研发人员：F·莫伊勒韦特，I·范登布莱德，S·C·弗赖伊，K·E·莫勒，L·弗兰科娃，T·J·西蒙斯，C·霍兰，A·哈德孙，
申请(专利权)人：拜尔作物科学公司，爱丁堡大学董事会，
类型：发明
国别省市：比利时;BE