由乙酸和甘油生产乙醇的工程化酵母菌株制造技术

本发明专利技术涉及用于由木质纤维素水解液生产乙醇的方法，该木质纤维素水解液包括己糖、戊糖和乙酸，由此使用经基因修饰的酵母细胞，其含有编码乙醛脱氢酶的外源基因和编码具有NAD+-连接的甘油脱氢酶活性的酶的细菌基因。该方法进一步的特征在于，甘油存在或者供应到培养基中，经修饰的酵母细胞由此发酵己糖、戊糖、乙酸和甘油为乙醇。本发明专利技术还涉及用于上述方法的酵母细胞。所述酵母细胞优选地地含有提高甘油利用的基因修饰，例如增加一种或多种二羟基丙酮激酶活性以及将甘油转运到细胞中的基因修饰。所述酵母细胞还进一步优选包括功能化的外源木糖异构酶基因和/或功能化的外源基因，其赋予细胞将L-阿拉伯糖转化为D-木酮糖-5-磷酸的能力，并且它们可以包括增加乙酰-CoA合成酶活性的基因修饰。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】由乙酸和甘油生产乙醇的工程化酵母菌株
本专利技术涉及微生物例如酵母菌体内的代谢工程。特别地，本专利技术涉及由乙酸和甘油生产乙醇的已经工程化酵母菌株。除了乙酸和甘油，该酵母菌株还可以消耗己糖和戊糖，以用于生产乙醇。本专利技术还涉及本专利技术的工程化菌株由乙酸和甘油生产乙醇的方法。
技术介绍
第二代生物乙醇是通过将例如植物生物质(plantbiomass)的木质纤维素组分水解成用于发酵成乙醇的游离的单糖(例如己糖和戊糖)而生产的。木质纤维素水解液含有大量的乙酸，乙酸是用于生产乙醇的微生物(例如酵母菌)的发酵能力的强效抑制剂。Sonderegger等(2004,Appl.Environ.Microbiol.70:2892–2897)公开了磷酸转乙酰酶和乙醛脱氢酶在木糖发酵酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株中的异源表达。通过结合天然的磷酸转酮酶(phosphoketolase)，Sonderegger等由此创造了功能化的磷酸转酮酶途径，该途径具有NADH的净再氧化(netreoxidation)的能力，NADH通过木糖还原酶和木糖醇脱氢酶(在菌株中用于木糖的利用)的异源表达产生。Guadalupe等(2009,Appl.Environ.Microbiol.doi:10.1128/AEM.01772-09)公开了一种酿酒酵母菌株，在该菌株中通过破坏内源性依赖NAD的甘油-3-磷酸脱氢酶基因(GPD1和GPD2)消除了副产品甘油的生产。大肠杆菌mhpF基因(编码乙酰化依赖NAD的乙醛脱氢酶)的表达修复了GPD-破坏菌株通过补充含有乙酸的培养基以厌氧生长的能力。Yu等(2010,Bioresour.Technol.101(11):4157-61.Epub2010Feb9)公开了代谢工程化的酿酒酵母菌株，该菌株通过甘油脱氢酶(GCY)、二羟基丙酮激酶(DAK)和甘油摄取蛋白质(GUP1)的同时过表达，以提高由甘油生产乙醇的量。Lee和Dasilva(2006,MetabEng.8(1):58-65)公开了工程化酵母菌(酿酒酵母菌株)以通过尤其是(interalia)大肠杆菌的mgs和gldA基因的引入表达由甘油产生1,2-丙二醇。本专利技术的目的是提供一种用于能够由乙酸和甘油(以及己糖和戊糖)生产乙醇的菌株，以及这些菌株用于生产乙醇和/或其它发酵产物的方法。
技术实现思路
定义在本文中的序列同一性被定义为两条或多条氨基酸(多肽或蛋白质)序列或者两条或多条核苷酸(多核苷酸)序列之间的关系，这种关系是通过序列比对来确定的。在本领域中，“同一性”也指氨基酸或核酸序列之间的序列相关性的程度，这种情况可以通过匹配成串(strings)的序这种列来确定。通过将氨基酸序列和一条多肽的保守氨基酸取代与第二多肽序列比对来确定两条氨基酸序列之间的“相似性”。“同一性”和“相似性”可以通过已知的方法很容易地计算。术语“序列同一性”或“序列相似性”是指两条(多)肽或两条核苷酸序列，当最佳比对时，优选在其整个长度(比较时至少是最短序列)和最大化匹配的数量以及最小化间隙的数量(例如，由ClustalW程序(1.83)，GAP或BESTFIT使用默认参数)，共享至少一定百分比的如本文其他部分所定义的序列同一性。GAP使用Needleman和Wunsch全局比对算法以在它们的整个长度比对两条序列，最大化匹配的数量并且最小化间隙的数量。通常，该GAP默认参数随间隙建立罚分(gapcreationpenalty)＝50(核苷酸)/8(蛋白质)和间隙扩展罚分(gapextensionpenalty)＝3(核苷酸)/2(蛋白质)使用。对于核苷酸，使用的默认评分矩阵(defaultscoringmatrix)为nwsgapdna，对于蛋白质，使用的默认评分矩阵为Blosum62(Hentikoff&Hentikoff，1992，PNAS89，915-919)。优选的用于比对本专利技术的蛋白质序列的多重比对程序为应用替换矩阵(blosummatrix8)和默认设置(间隙开放罚分(Gapopeningpenalty)：10；间隙扩展罚分：0.05)的ClustalW(1.83)。它比当RNA序列被认为是与DNA序列基本上相似或具有一定程度的序列同一性时清晰，DNA序列中的胸腺嘧啶(T)被认为等于RNA序列中的尿嘧啶(U)。用于序列同一性百分比的序列比对和分数的确定可以通过使用计算机程序例如GCGWisconsinPackage，版本10.3，购自AccelrysInc.,9685ScrantonRoad,SanDiego,CA92121-3752USA；或使用用于Windows的开源软件Emboss(目前版本2.7.1-07)。备选地，相似性或同一性的百分数可以通过使用例如FASTA、BLAST等的数据库来搜索确定。设计确定同一性的优选方法以在测试的序列间产生最大的匹配。确定同一性和相似性的方法编纂在公开可用的计算机程序中。优选的确定两个序列同一性和相似性的计算机程序方法包括例如GCG程序包(Devereux、J.,etal.,NucleicAcidsResearch12(1):387(1984))、BestFit、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul、S.F.etal.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)。BLASTX程序是从NCBI和其他来源(BLASTManual、Altschul,S.,etal.,NCBINLMNIHBethesda，MD20894；Altschul，S.,etal.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990))公开可获得的。还可以使用众所周知的SmithWaterman算法来确定同一性。优选的用于多肽序列比对的参数包括如下：算法(Algorithm)：NeedlemanandWunsch,J.Mol.Biol.48:443-453(1970)；比对矩阵(Comparisonmatrix)：BLOSSUM62来自HentikoffandHentikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:10915-10919(1992)；间隙罚分(GapPenalty)：12；和间隙长度罚分(GapLengthPenalty)：4。就像来自位于麦迪逊，威斯康星州(Madison,WI)的遗传学电脑集团的“Ogap”程序一样，带有这些参数的有用的程序是公开可获得的。前述的参数为用于氨基酸比对(对于端隙(endgaps)不伴随罚分(penalty))的默认参数。优选的用于核酸比对的参数包括如下：规则系统：NeedlemanandWunsch,J.Mol.Biol.48:443-453(1970)；比对矩阵：匹配(matches)＝+10，失配(mismatch)＝0；间隙罚分：50；间隙长度罚分：3。可获得如来自麦迪逊，威斯康星州(Madison,Wis)的遗传学电脑集团的间隙程序。以上给出的是核酸比对的默认参数。任选地，本领域技术人员清楚的是，在确定氨基酸相似性程度时，本领域技术人员还可以考虑称为“保守的”氨基酸取代。保守的氨基酸取代指的是具有相似的侧链的残本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产乙醇的方法，其中，该方法包括用酵母细胞发酵培养基的步骤，其中，所述培养基含有或被供给：a)己糖源和戊糖源中的至少一种；b)乙酸源；以及c)甘油源，所述酵母细胞以此发酵乙酸、甘油，以及己糖和戊糖中的至少一种成为乙醇，并且任选地，回收乙醇，其中，所述酵母细胞包括编码具有乙醛脱氢酶活性的酶的外源基因，该基因赋予细胞将乙酸转化为乙醇的能力，以及其中，所述酵母细胞包括编码具有NAD+‑连接的甘油脱氢酶活性的酶的细菌基因。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.11.30 EP 11191333.1;2011.11.30 US 61/564,9321.一种生产乙醇的方法，其中，该方法包括用酵母细胞发酵培养基的步骤，其中，所述培养基含有或被供给：a)己糖源和戊糖源中的至少一种；b)乙酸源；以及c)甘油源，所述酵母细胞以此发酵乙酸、甘油，以及己糖和戊糖中的至少一种成为乙醇，并且任选地，回收乙醇，其中，所述酵母细胞包括编码具有乙醛脱氢酶活性的酶SEQIDNO:1、SEQIDNO:3或SEQIDNO:5的外源基因，该基因赋予细胞将乙酸转化为乙醇的能力，以及其中，所述酵母细胞包括编码具有NAD+-连接的甘油脱氢酶活性的酶SEQIDNO:7的细菌基因。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述酵母细胞包括降低细胞中NAD+依赖性甘油3-磷酸脱氢酶比活的基因修饰。3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述降低细胞中NAD+依赖性甘油3-磷酸脱氢酶的比活的基因修饰为降低或者失活编码磷酸甘油脱氢酶的内源基因的表达的基因修饰，所述磷酸甘油脱氢酶具有与SEQIDNO:16至少具有70％的序列同一性的氨基酸序列。4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述酵母细胞包括增加二羟基丙酮激酶比活的基因修饰，其中，所述基因修饰过表达编码二羟基丙酮激酶的核苷酸序列。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述编码二羟基丙酮激酶的核苷酸序列包括编码与SEQIDNO:8、SEQIDNO:9和SEQIDNO:25中的至少一种具有至少50％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞还包括增加下列中的至少一种的基因修饰：i)特异性的乙酰-CoA合成酶活性；以及ii)将甘油转运到细胞中。7.根据权利要求2所述的方法，其中，所述细胞还包括增加下列中的至少一种的基因修饰：i)特异性的乙酰-CoA合成酶活性；以及ii)将甘油转运到细胞中。8.根据权利要求3所述的方法，其中，所述细胞还包括增加下列中的至少一种的基因修饰：i)特异性的乙酰-CoA合成酶活性；以及ii)将甘油转运到细胞中。9.根据权利要求4所述的方法，其中，所述细胞还包括增加下列中的至少一种的基因修饰：i)特异性的乙酰-CoA合成酶活性；以及ii)将甘油转运到细胞中。10.根据权利要求6所述的方法，其中所述基因修饰过表达编码乙酰-CoA合成酶的核苷酸序列。11.根据权利要求6所述的方法，其中，相比于由酿酒酵母(S.cerevisiae)ACS1基因编码的乙酰-CoA合成酶，所述编码乙酰-CoA合成酶的核苷酸序列编码的乙酰-CoA合成酶具有更高的最大速率，或者其中，相比于由酿酒酵母ACS2基因编码的乙酰-CoA合成酶，所述编码乙酰-CoA合成酶的核苷酸序列编码的乙酰-CoA合成酶对醋酸具有更高的亲和力，并且其中，提高将甘油转运到细胞中的所述基因修饰过表达编码甘油摄取蛋白和甘油通道中的至少一种的核苷酸序列。12.根据权利要求11所述的方法，其中编码甘油摄取蛋白的核苷酸序列包括编码与SEQIDNO:10和SEQIDNO:11中的至少一种具有至少50％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。13.根据权利要求11所述的方法，其中编码甘油通道的核苷酸序列包括编码与SEQIDNO:12的250位和530位氨基酸之间的氨基酸序列具有至少30％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。14.根据权利要求6所述的方法，其中，所述基因修饰在厌氧条件下增加特异性的乙酰-CoA合成酶活性。15.根据权利要求11所述的方法，其中，所述基因修饰在厌氧条件下增加特异性的乙酰-CoA合成酶活性。16.根据权利要求12所述的方法，其中，所述基因修饰在厌氧条件下增加特异性的乙酰-CoA合成酶活性。17.根据权利要求13所述的方法，其中，所述基因修饰在厌氧条件下增加特异性的乙酰-CoA合成酶活性。18.根据权利要求1所述的方法，其中，所述酵母细胞至少包括：i)功能化的外源性木糖异构酶基因，该基因赋予细胞将木糖异构化为木酮糖的能力；以及ii)编码L-阿拉伯糖异构酶、L-核酮糖激酶和L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶的功能化的外源基因，这些基因一起赋予细胞将L-阿拉伯糖转化为D-木酮糖-5-磷酸的能力。19.根据权利要求2所述的方法，其中，所述酵母细胞至少包括：i)功能化的外源性木糖异构酶基因，该基因赋予细胞将木糖异构化为木酮糖的能力；以及ii)编码L-阿拉伯糖异构酶、L-核酮糖激酶和L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶的功能化的外源基因，这些基因一起赋予细胞将L-阿拉伯糖转化为D-木酮糖-5-磷酸的能力。20.根据权利要求3所述的方法，其中，所述酵母细胞至少包括：i)功能化的外源性木糖异构酶基因，该基因赋予细胞将木糖异构化为木酮糖的能力；以及ii)编码L-阿拉伯糖异构酶、L-核酮糖激酶和L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶的功能化的外源基因，这些基因一起赋予细胞将L-阿拉伯糖转化为D-木酮糖-5-磷酸的能力。21.根据权利要求4所述的方法，其中，所述酵母细胞至少包括：i)功能化的外源性木糖异构酶基因，该基因赋予细胞将木糖异构化为木酮糖的能力；以及ii)编码L-阿拉伯糖异构酶、L-核酮糖激酶和L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶的功能化的外源基因，这些基因一起赋予细胞将L-阿拉伯糖转化为D-木酮糖-5-磷酸的能力。22.根据权利要求5所述的方法，其中，所述酵母细胞至少包括：i)功能化的外源性木糖异构酶基因，该基因赋予细胞将木糖异构化为木酮糖的能力；以及ii)编码L-阿拉伯糖异构酶、L-核酮糖激酶和L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶的功能化的外源基因，这些基因一起赋予细胞将L-阿拉伯糖转化为D-木酮糖-5-磷酸的能力。23.根据权利要求6所述的方法，其中，所述酵母细胞至少包括：i)功能化的外源性木糖异构酶基因，该基因赋予细胞将木糖异构化为木酮糖的能力；以及ii)编码L-阿拉伯糖异构酶、L-核酮糖激酶和L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶的功能化的外源基因，这些基因一起赋予细胞将L-阿拉伯糖转化为D...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·A·M·德邦，A·W·R·H·托伊尼森，P·克阿拉森，W·W·A·哈特曼，S·范博伊塞克姆，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL