拟南芥磷酸甘露糖异构酶基因在植物遗传转化中的应用。本发明专利技术提供了一种利用磷酸甘露糖异构酶基因AtPMI培育转基因植物细胞的方法以及含有该磷酸甘露糖异构酶基因AtPMI的表达盒、表达载体等在培育转基因植物细胞中的应用。本发明专利技术以该基因为安全筛选标记，应用于转基因植物的生产。本发明专利技术利用AtPMI基因构建的植物表达载体，以甘露糖为筛选剂，成功实现了转化水稻细胞。由于AtPMI来源于拟南芥，环境友好，对人类没有潜在危险，可以用于替代来自大肠杆菌的PMI，从而更有利于转基因产品的推广利用，消除人们对转基因技术的疑虑。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术和植物基因工程
具体而言，本专利技术涉及一种来自 拟南芥（Arabidopsis thaliana)的磷酸甘露糖异构酶基因 AtPMI,并以其作为安全筛选标 记基因，应用于植物遗传转化，实现对转化细胞的有效筛选。
技术介绍
转基因技术，是20世纪80年代初发展起来的一种有效的植物定向改良方法。该 技术主要通过农杆菌介导、基因枪转化等方法将目的基因导入受体，经过标记筛选和分子 检测，获得稳定表达的转化体，实现目标性状的快速定向改良，具有可用基因资源广、改良 效率高等优点。转基因技术为农作物的产量提升、品质改良和抗性增强提供了新路径、开拓 了新空间。全球转基因作物的研发和应用正步入快车道。由于转基因作物的基因来源超越 了本物种的范围，打破了原有物种生殖隔离的界限，转基因技术的潜在安全风险也引起广 泛关注。 筛选标记基因的潜在安全风险是目前公众对转基因技术担忧的一个重要方面。现 有转基因技术，主要使用抗生素抗性基因作为筛选标记。抗生素标记基因与插入的目的基 因一起转入目标作物中，用于帮助在植物遗传转化筛选和鉴定转化的细胞、组织和再生植 株。标记基因本身并无安全性问题。但该类基因可能随食物进入肠道，存在与肠道微生物 基因交换产生耐药菌株的潜在风险，以致影响抗生素的医用效果。为了替代抗生素抗性基 因，其他类型筛选标记基因被陆续研宄开发，如除草剂抗性基因、氨基酸代谢筛选基因、可 视标记基因等，但这些筛选标记基因要么存在类似问题，要么筛选效率和成本不适于规模 化应用。 为避免对抗生素等传统筛选剂的依赖，降低抗生素抗性基因等筛选标记的潜在风 险，近年来一些安全性更好的筛选标记基因应用于转基因作物的研发，并取得了很好的效 果。如磷酸甘露糖异构酶（phosphate mannose isomerase，PMI)基因是一种糖代谢基因， 水稻等许多高等植物细胞虽能将甘露糖转化为6-磷酸甘露糖，但由于细胞自身缺乏磷酸 甘露糖异构酶，或者表达量很低，不能进一步将6-磷酸甘露糖转化为6-磷酸果糖，从而进 入糖酵解途径而被利用。因此磷酸甘露糖异构酶可以作为筛选标记基因。而且与抗生素、 除草剂等负选择不同，甘露糖是进行正选择，转化的细胞表达磷酸甘露糖异构酶，可以利用 甘露糖为碳源而正常生长，筛选效率较高。甘露糖广泛存在于海藻、蕨类等植物中，同时PMI 的催化产物6-磷酸果糖是蜂蜜和果浆的主要成份，二者都是环境友好的天然物质。因此 PMI基因是一种安全筛选标记，有效避免了抗生素、除草剂等抗性基因存在的潜在风险。目 前，PMI筛选标记基因已在水稻、小麦、玉米、马铃薯等作物中得到成功应用，在开发安全性 较好的转基因作物及其产品方面，具有广泛的应用前景。 但现在广泛使用的磷酸甘露糖异构酶是从原核生物大肠杆菌中分离而来的，这是 因为目前人们还没有意识到从原核生物大肠杆菌中分离出的磷酸甘露糖异构酶可能对转 化受体基因组造成不利影响，还可能引发对其安全性的担忧，或者是人们对这种从原核生 物大肠杆菌中分离出的PMI的安全性没有引起足够的重视。因此，本领域有对安全性更好 的高等植物源PMI筛选标记基因的迫切需求，但目前还没有高等植物源的PMI筛选标记基 因的报道。
技术实现思路
本申请的专利技术人基于在转基因领域多年的研宄经验，首先意识到了从原核生物大 肠杆菌中分离出的磷酸甘露糖异构酶可能对转化受体基因组造成不利影响，还可能引发对 其安全性的担忧。 针对目前使用的PMI筛选标记的安全性问题，以及高等植物源PMI筛选标记基因 研宄较少的现状，本专利技术以高等植物来源的磷酸甘露糖异构酶基因为安全的筛选标记基因 进行植物遗传转化。为了能够获得高等植物来源的磷酸甘露糖异构酶基因，本申请的专利技术 人针对可能含有磷酸甘露糖异构酶基因的不同高等植物，进行了大量植物提取实验和酶活 分析，并最终从拟南芥中成功克隆了具有较强磷酸甘露糖异构酶活性的AtPMI，并以其基因 作为筛选标记基因，成功获得了转基因植物。 具体而言，在第一个方面，本专利技术提供一种培育水稻转化细胞的方法，其特征在 于，所述方法在进行水稻转化细胞培育时以来自拟南芥的磷酸甘露糖异构酶基因 AtPMI作 为筛选标记。 优选地，所述磷酸甘露糖异构酶基因 AtPMI的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，或 者，所述磷酸甘露糖异构酶基因 AtPMI的核苷酸序列为在SEQ ID NO: 1所示序列中添加、缺 失或者取代一个或多个序列的衍生物。 在不影响憐酸甘露糖异构酶基因 AtPMI的标记功能的情况下，在其编码蛋白基础 上，添加、缺失或者取代一个或多个氨基酸序列也能够实现本专利技术的功能，因此，在本专利技术 的保护范围内。 优选地，所述方法包括下述步骤： (1)将水稻种子去壳、灭菌后将胚分离出来，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次 级愈伤组织； (2)将所述次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基进行预培养，获得可用 于转化的愈伤组织； (3)将步骤（2)中获得的愈伤组织与农杆菌接触10-30分钟，其中，所述农杆菌中 引入了植物表达载体，所述植物表达载体中携带序列如SEQ ID NO: 1所示DNA的磷酸甘露 糖异构酶基因； (4)将步骤（3)处理后的愈伤组织转移到其上垫有无菌滤纸的培养皿中，21-23°C 培养第一预定时间； (5)将步骤（4)处理后的愈伤组织置于前筛选培养基上培养第二预定时间； (6)将步骤（5)处理后的愈伤组织转移筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织，即可 代谢甘露糖的水稻转化细胞。 其中所述步骤（1)中的种子是成熟种子；所述步骤（1)、（2)中的诱导培养基是说 明书表1所列出的诱导培养基；所述步骤（3)中的与农杆菌接触是将愈伤组织浸泡在所述 农杆菌悬浮液中；所述步骤（4)中的农杆菌悬浮培养基是说明书表1所列出的悬浮培养基； 所述步骤（5)中的前筛选培养基是说明书表1所列出的前筛选培养基；所述步骤（6)中的 筛选培养基是说明书表1所列出的筛选培养基。 在上述的方法中，本专利技术利用了 pCAMBIA1381-AtPMI表达载体，进而获得水稻转 化细胞。 在优选的实施方案中，其中所述水稻是粳稻，更优选地，所述水稻是粳稻品种日本 晴。 另一方面，本专利技术提供一种拟南芥的磷酸甘露糖异构酶基因 AtPMI的应用，其特 征在于，所述应用包括利用所述磷酸甘露糖异构酶基因 AtPMI作为筛选标记，基于上述的 方法，获得植物转化细胞，并利用所获得的植物转化细胞获得转基因植物或植物部分。 优选地，所述植物包括：粮食作物、蔬菜作物、花丼作物、能源作物。 优选地，所述植物部分包括：细胞、原生质体、细胞组织培养物、愈伤组织、细胞块、 胚芽、花粉、胚珠、花瓣、花柱、雄蕊、叶、根、根尖、花药和种子。 另一方面，本专利技术提供一种原核表达载体在获取转基因植物中的应用，其特征在 于，所述原核表达载体包含SEQ ID N0:1所示的磷酸甘露糖异构酶基因 AtPMI，并且在所述 应用中，所述磷酸甘露糖异构酶基因 AtPMI用作筛选标记。 另一方面，本专利技术提供一种表达盒在获取转基因植物中的应用，其特征在于，所述 表达盒中包含SEQ ID NO: 1所示的磷酸甘露糖异构酶基因 AtPMI，并且在所述应用中，所述 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种培育水稻转化细胞的方法，其特征在于，所述方法在进行水稻转化细胞培育时以来自拟南芥的磷酸甘露糖异构酶基因AtPMI作为筛选标记。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李浩，杨剑波，魏鹏程，李娟，杨亚春，李莉，秦瑞英，马卉，
申请(专利权)人：安徽省农业科学院水稻研究所，
类型：发明
国别省市：安徽;34
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。