本发明专利技术涉及一种CRISPR/Cas9制备CAR-T细胞的方法，其制备方法为利用CRISPR/Cas9技术将CAR分子整合到人第19号染色体上AAVS1位点的第一个内含子内；利用CRISPR/Cas9将各类肿瘤表面抗原的抗体分子整合到人类T细胞基因组中AAVS1位点的应用。利用该技术，我们可以将CAR分子精确地整合到人T细胞基因组特定的“安全港”位点，不影响任何人体正常基因的功能，避免了使用病毒载体存在的安全隐患和外源基因转机插入基因组的遗传毒性和免疫原性等一系列临床风险问题。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属于生物学领域。
技术介绍
免疫系统是人体的防御体系，一方面发挥着清除细菌、病毒、外来异物的功能，另 一方面消除体内衰老细胞以及发生突变的细胞，有的突变细胞会变成癌细胞。机体免疫系 统和癌细胞相互作用的结果决定了癌症的最终演变。对于健康的人来说，其免疫系统的强 大足以及时清除体内因突变产生的癌细胞。但对于癌细胞病人来说，普遍存在免疫系统低 下、不能有效地识别、杀灭癌症细胞；另一方面，癌症细胞大量增殖，会进一步抑制患者的免 疫功能，而且，癌症细胞有多种机制来逃脱免疫细胞的识别与杀伤，癌症的免疫治疗就是借 助分子生物学技术和细胞工程技术，提高癌症的免疫原性，给机体补充足够数量的功能正 常的免疫细胞和相关分子，激发和增强机体抗瘤免疫应答，提高癌症对机体抗癌症免疫效 应的敏感性，在体内、外诱导癌症特异性和非特异性效应细胞和分子，达到最终清除癌症的 目的。癌症免疫治疗正是通过人为的干预，来调动机体自身的免疫系统对癌细胞进行杀灭 和抑制其增殖。 肿瘤免疫治疗技术主要包括利用CTL细胞、DC瘤苗、CIK细胞、DC-CIK细胞、 NK细胞、TIL细胞、TCR细胞和CAR-T细胞等进行治疗。最近一两年，从中脱颖而出的是 CAR-T细胞治疗。该疗法通过分离患者外周血液中的免疫T细胞，在体外无菌培养，然后 经过基因工程改造，也就是根据患者所患的肿瘤类型进行特异性的基因修饰和体外扩增， 最后回输患者的体内，达到杀死肿瘤细胞的目的（Figueroa JA et al, Int Rev Immunol 2015, 34(2) :154-87) 〇 目前，欧美及亚洲各国都在积极开展CAR-T疗法的临床试验，包括美国、英国、瑞 典、中国、日本等。其中，美国开展临床试验项目最多、达41项，占据了全球CAR-T疗法 临床试验的74. 5%。宾夕法尼亚大学医院、费城儿童医院、美国癌症研宄院（NCI)、Fred Hutchinson癌症研宄中心、纪念斯隆凯特琳癌症中心和西雅图儿童医院等是最早开展 CAR-T细胞疗法的研宄机构。中国在CAR-T疗法领域起步较晚，目前仅北京大学肿瘤医院 和解放军总医院（301医院）、四川华西医院在开展相关临床试验而且临床目前仅限于白血 病，实体肿瘤CAR-T治疗鲜有报道。新兴生物制药公司如Juno、Kite、Celgene、Cellectis、 Bluebird，传统制药公司如诺华、葛兰素史克、辉瑞、强生等都投入到了 CAR-T疗法的研发 中，推动这一极具前景的疗法尽早进入到临床，从而造福癌症及肿瘤患者。 (A service of the U. S. National Institute of Health, http: // clinicaltrials. gov)〇 虽然许多机构都在进行CAR-T疗法的研宄，但目前并没有统一的标准，他们在CAR 设计、培养技术、淋巴细胞去除方法以及所治疗的疾病等方面都有不同。如美国国家癌症 研宄院（NCI)使用的是靶向⑶19含⑶28共刺激域的第二代CAR，且通过逆转录病毒进行 基因转导，使用0KT3和IL2扩增，治疗疾病是非霍奇金淋巴瘤，而宾夕法尼亚大学研宄人 员使用的是加入4-1BB共刺激分子的第二代CAR，使用抗-⑶3/⑶28扩增，通过慢病毒载 体转导，治疗疾病是 ALL 和 CLL(Mazzarella L.2013American Society of Haematology meeting2014, 8:390)〇 CAR-T细胞疗法在晚期难治性白血病和淋巴瘤患者中进行的早期临床试验已经显 示出非常振奋人心的结果。宾夕法尼亚大学研宄人员今年10月在世界顶尖医学杂志《新英 格兰医学杂志》上发表的一项临床试验结果显示，在接受了 CTL019输注（靶向⑶19抗原 的CAR-T疗法）的30名复发性或难治性ALL受试者中，治疗后1个月有27名患者获得完 全缓解，其中甚至包括15位已经接受过骨髓干细胞移植的患者。6个月时无反复生存率为 67% (20人），总体生存率为78% (23人）。另外还有1名患者2年随访时仍然持续完全缓 解（Grupp SA et al, N Engl J Med 2013,368(16):1509-18)。 NCI开展的一项临床试验也展现了良好的结果，该试验入组了 20名ALL患儿，在 接受CAR-T细胞疗法后，14名达到了完全缓解；12名患儿的骨髓中已检测不到未成熟的白 血病细胞，其中10名又接受了干细胞移植，至今无癌生存。研宄结果还表明，CAR-T细胞 疗法可帮助化疗无应答的患者顺利地过度到骨髓移植治疗。纪念斯隆凯特林癌症中心与 NCI在成人患者中开展的1期临床试验也取得了类似的结果（Mazzarella L. 2013American Society of Haematology meeting2014, 8:390)〇 除白血病之外，CAR-T疗法对淋巴瘤也显示了喜人的疗效，NCI领导的CAR-T细胞 临床试验招募了 15名成人受试者，其中的绝大多数（9名）都患有晚期弥漫性大B细胞淋 巴瘤（DLBCL)。据Kochenderfer博士及NCI的同事报道，该临床试验的大多数患者都达到 了缓解，在7例可评估的DLBCL受试者中4例获得完全缓解，持续时间从9个月到22个月 (Kochenderfer JN et al，Blood 2012, 119(12):2709-20)〇 这些临床试验的其他结果也非常鼓舞人心。比如，CAR-T细胞在被输注到患者体 内后数量急剧增加，在有些患者中其数量增加多达1000倍。此外，CAR-T细胞输注后，患者 的中枢神经系统中也检测到了 CAR-T细胞，中枢神经系统可以说是恶性肿瘤的避难所-- 少量癌细胞逃脱化疗或放疗后的藏身之处。在NCI开展的儿童临床试验中，CAR-T细胞疗 法就根除了两名患儿的已转移至中枢神经系统的癌症。如果CAR-T细胞能够在这些部位持 久发挥作用，那么它们将有助于防止癌症复发。 但是目前国际上用于临床试验的CAR-T细胞普遍是采用病毒载体来将CAR分子导 入T细胞中的，从临床治疗安全角度来考虑存在较大的风险。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提出， 该方法可以将CAR分子定点整合到T细胞的基因组中，避免了使用病毒载体制备CAR-T细 胞存在的安全隐患，能应用于科研评估临床治疗各类癌症患者。 为达到上述目的，本专利技术的技术方案如下：一种CAR-T细胞制备方法，利用 CRISPR/Cas9技术将CAR分子整合到人第19号染色体上AAVSl位点的第一个内含子内。 优选的，提供供体DNA序列，在CAR分子序列上游含有剪切体受体序列和AAVSl左 同源臂序列，CAR分子下游含有poly-A序列和AAVSl右同源臂序列。 -种CAR-T细胞的应用，利用CRISPR/Cas9将各类肿瘤表面抗原的抗体分子整合 到人类T细胞基因组中AAVSl位点的应用。 更进一步，利用CRISPR/Cas9技术制备的CAR-T细胞在评估各类CAR分子对肿瘤 细胞的杀伤力和对正常细胞的副作用，以及临床治疗血癌和各类实体肿瘤中的应用。 本专利技术的有益效果：CRISPR/Cas9系统本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用CRISPR/Cas9制备CAR‑T细胞的方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9技术将CAR分子整合到人第19号染色体上AAVS1位点的第一个内含子内。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：熊波，
申请(专利权)人：南京凯地生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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