MAIT样细胞及其制作方法技术

本发明专利技术的课题在于提供由MAIT细胞制作人工多能干细胞的方法、以及MAIT细胞来源的人工多能干细胞。另外，本发明专利技术的课题在于提供由人工多能干细胞制作MAIT样细胞的方法、以及MAIT样细胞。通过本发明专利技术，可以将具有MAIT细胞特异的TCR基因的人工多能干细胞分化诱导，从而建立MAIT样细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及由MAIT细胞制作人工多能干细胞的方法、以及MAIT细胞来源的人工 多能干细胞。另外，本专利技术涉及由人工多能干细胞制作MAIT样细胞的方法、以及由此得到 的MAIT样细胞。
技术介绍
MAIT 细胞（Mucosal associated invariant T cells，粘膜相关的恒定 T 细胞） 可产生各种细胞因子以控制各种免疫反应，是作为承担自然免疫和获得免疫的"桥梁作用" 的细胞而已知的自然免疫T淋巴细胞的一种。MAIT细胞在人中丰富地存在，例如在肝脏中 的T细胞中占20-50%，占肠道粘膜淋巴细胞固有层（lamina propria lymphocytes :LPL) 或外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells :PBMC)的 1-10%，另一方面， 在小鼠中为稀有的细胞（Dusseaux et al.，2011 ;Le Bourhis et al.，2011)。 作为MAIT细胞的另一特征，可以举出T细胞受体（T cell rec印tor :TCR)的单 一性。T细胞特异性表达的TCR将与主要组织相容性复合体（Major Histocompatibility Complex :MHC)分子结合的肽片段作为抗原进行识别。TCR由在细胞表面表达的两个多 肽链、a链和|3链构成，两条链均在N末端的抗原结合区针对被称为可变（variable: V)区的每个TCR分子具有氨基酸序列不同的部位，该V区的多样性决定了免疫反应中的 T细胞的抗原特异性。TCR的V区与免疫球蛋白同样地由包括多个亚型的V(Variable)、 D (Diversity)、J (Joining)基因片段构成，a链中V和J的各1个片段通过DNA重组而结 合，0链中V、D、J的各1个片段通过DNA重组而结合，形成了编码该区域的基因。 另一方面，在T细胞中，作为其TCR未呈多样性的单一的细胞，已知自然杀伤T细 胞（Natural killer T cells :NKT细胞）和MAIT细胞这两种。在人的情况下，MAIT细胞 的TCRa链仅为Va7. 2_Ja33的组合，在NKT细胞的情况下，其组合为Va24_Ja 18(Le Bourhis et al.，2011)。另外，在小鼠的情况下，MAIT细胞的TCRa链仅为Val9_Ja33 的组合，在NKT细胞的情况下，其组合为V a 14-J a 18。对两细胞的TCR来说，能够结合的 抗原呈递分子（约束性）也不同，MAIT细胞的TCR识别?结合与一般的T细胞中的抗原 呈递分子MHC类似的、无多样性的MR1 (MHC-相关分子-1)，在NKT的情况下，将MHC类似的 (Did (cluster of differentiation (分化群）-Id)作为抗原呈递分子。MAIT细胞特异性 的TCR和MR1以进化良好的方式被保存，暗示了在广泛物种中的功能重要性（Le Bourhis et al. , 2011) 〇 MAIT细胞在表达上述invariant TCRa链的同时，作为特异性的表面抗原标记 分子而表达作为C型凝集素的⑶161(别名，natural killer cell surface protein(自 然杀伤细胞表面蛋白）：NKRP1)和白细胞介素（IL)-18受体a链（IL_18Ra) (Cosmi et al.，2008 ;Le Bourhis et al.，2010)。即，MAIT细胞可以与CD3等一般性的T细胞标记物 一同作为表达MAIT特异性的invariant TCRa链、⑶161、IL_18Ra的细胞来进行规定。另 外，MAIT细胞呈现出⑶45RA\⑶45R0+、⑶95high、⑶62L 1?等效应/记忆型T细胞的性状，同 时由于趋化因子受体的表达为CCR9int、CCR7' CCR5high、CXCR6high、CCR6high，因而暗示了向肠 道或肝脏等的归位指向性Ousseaux et al.，2011)。 另外，据报道：MAIT细胞在产生干扰素（IFN)y、IL-17、IL-2等细胞因子、或颗 粒酶B的同时，几乎不显示出增殖性，表达多药耐药性转运体ABCB1而显示出多药耐药 性（Dusseaux et al.，2011)。通过这些特性，暗示了 MAIT细胞对于肠内细菌产生的异物 具有抵抗性，和/或参与生物体内的感染防御系统。事实上，据报道MAIT细胞是与感染 结核菌等细菌或真菌的细胞发生反应的特殊的T细胞，同时在结核等的细菌感染患者中 发现了 MAIT细胞的减少，并且由使用了小鼠的模型实验表明，MAIT细胞防御脓肿分枝杆 菌（Mycobacterium abscessus)、大肠杆菌（Escherichia coli)的感染（Le Bourhis et al.，2010 ;Gold et al.，2010 ;Dusseaux et al.，2011)。由以上的结果推测了 MAIT细胞作 为针对细菌感染的自然免疫淋巴细胞的功能。 此外，MAIT细胞暗示了与以多发性硬化症为代表的自身免疫性疾病、炎症性疾病、 癌的发病和发展的相关性。CD8+/CD161 highT细胞集聚于肝脏或关节等的炎症部位，是被认 为是多发性硬化症的发病原因的T细胞群，表明，在人PBMC中CD8+/CD161 highT细胞的90% 为作为MAIT细胞特异性的TCR a链的V a 7. 2+(Walker et al.，2011)。进而，据报道，在 多发性硬化症患者中其病变部集聚有更多的MAIT细胞（Illes et al.，2004;Miyazaki et al.，2011)。还有报道称，MAIT细胞的集聚为肾癌或脑肿瘤（Peterfalvi et al.，2008)、慢 性炎症性脱髓鞘性多发性神经病（Illes et al.，2004)。另外，关于以溃疡性结肠炎或克隆 病为代表的炎症性肠疾病，据报道，引入的MAIT细胞对药物引起的炎性组织损伤具有保护 作用（Xiao Ruijing et al.，2012)。 这样，MAIT细胞被暗示参与各种疾病或病状，但现状是，关于免疫控制机制、特别 是自然免疫中的作用及其详细的机理、有助于其的因子及分子、进而在病状发病和发展中 的意义等，还未进行充分的研宄和分析。作为其重要的原因之一，可以举出能够供体外（in vitro)及体内（in vivo)试验的细胞来源的问题。 如上所述，在作为实验用动物而频繁使用的小鼠中，MAIT细胞是非常稀有的细胞 群，难以使用该动物进行功能分析。另一方面，与小鼠相比，MAIT细胞在人中丰富地存在，但 是由外周血等人生物体试样大量制备MAIT细胞存在界限。另外，在这种方法中，所得到的 MAIT细胞的数量及性质发生大幅变动的可能性也高，使用该细胞的试验的稳定性和再现性 存在困难。进而，MAIT细胞通常为几乎不具有细胞增殖能力的状态，而且诱导其增殖的因 子及刺激未被确定，因此在in vitro条件下无法增殖（Dusseaux et al.，2011)。所以，作 为为了广泛进行使用MAIT细胞的研宄的一个解决方案，例如考虑了利用与MAIT细胞功本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种MAIT样细胞的制作方法，其包括：向MAIT细胞中导入初始化因子，得到保持以MAIT细胞特异的方式重构的TCRα链基因的人工多能干细胞；接着，将该人工多能干细胞分化诱导，得到MAIT样细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：若尾宏，藤田博美，小清水右一，吉清和则，
申请(专利权)人：第一三共株式会社，国立大学法人北海道大学，
类型：发明
国别省市：日本;JP