利用口腔上皮细胞制作单细胞测序参考品的方法技术

本发明专利技术涉及利用口腔上皮细胞制作单细胞测序参考品的方法，包括以下步骤：a)刮取口腔上皮细胞，保存在PBS中；b)在显微镜下，用毛细口吸管吸取单个口腔上皮细胞；c)单细胞全基因组扩增，扩增后用磁珠法纯化；d)对扩增样本进行酶切，用EDTA终止实验，磁珠法纯化；e)Proton文库构建；f)Proton半导体高通量测序平台进行上机测序；g)测序数据分析。本发明专利技术提供了一种单细胞相关研究的标准品制备新途径，具有取材简单、操作方便、快捷、高分辨率的特点，适用于PGS、肿瘤早期筛查等项目。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学
，具体地说，涉及利用口腔上皮细胞制作单细胞测序参考品的方法。
技术介绍
随着基因测序技术水平的提高以及千人基因组计划、癌症基因组计划、Meta-Hit计划等重大国际合作项目的相继开展，基因组研究日渐被推向高潮。然而，迄今为止使用的测序材料无一例外都是数百万甚至更多细胞的混合DNA样本。这种方法能够得到全基因组序列信息，但是对其进行研究得到的结果只是一群细胞中信号的平均值，或者只代表其中占优势数量的细胞信息，单个细胞独有的特性被忽视。另一方面，有些样品稀少无法在实验室培养，样品量不足以进行全基因组分析，例如肿瘤循环细胞、组织微阵列、早期发育的胚胎细胞等。这些都是全基因组测序遇到的难题。近年来，流式细胞分选和激光捕获显微切割技术的出现以及单细胞全基因组扩增技术的不断改进，让大量单细胞的捕获和检测成为可能。单细胞测序技术正逐渐从实验研究方法成为指导临床的有利工具，也逐渐发展出很多的临床应用。目前基于单细胞水平的临床应用研究主要集中在胚胎植入前检测及肿瘤研究方面。利用高通量测序技术对胚胎进行植入前遗传学筛查(Preimplantation Genetic Screening，PGS)，是通过分离少量的胚胎细胞进行单细胞测序，从而检测体外培养的胚胎染色体数目和结构异常，挑选正常的胚胎植入子宫，对获得正常的妊娠，提高临床妊娠率和活产率，降低多胎妊娠具有重要意义。而在技术研发过程中以及数据分析过程中，需要有相应的正常单细胞对照样本进行对比分析。肿瘤研究方面，肿瘤的异质性是目前研究较多的方向之一，肿瘤在生长过程中，由于其分裂增殖的无限性，突变率增加，其子细胞呈现出分子生物学或基因方面的改变，从而使肿瘤的生长速度、侵袭能力、对药物的敏感性、预后等各方面产生差异。简单点说就是同一肿瘤中可以存在有很多不同的基因型或者亚型的肿瘤细胞。因此同一种肿瘤在不同的个体身上可表现出不一样的治疗效果及预后，甚至同一个体身上的肿瘤细胞也存在不同的特性和差异。因此在单细胞水平上研究肿瘤细胞，对于肿瘤的检测和研究甚至个体化医疗方面具有重要意义。而肿瘤单个细胞的研究同样需要有正常的体细胞进行对照分析。此外，基于临床应用的试剂盒在开发过程中需要有对照样本进行试剂盒的性能评价。在后续的试剂盒注册审批过程中也需要有相应的标准品进行注册检验。因此进行单细胞研究首先要建立单细胞对照样本，但是由于临床样本的稀有和一系列社会学伦理学因素的制约，很难收集和处理临床样本。因此临床上迫切需要一种可以用于单细胞研究的简单有效的单细胞实验材料和处理方法。临床上常用的血液样本在分离有核细胞时，通常会受到红细胞等干扰，很难确保分离细胞的准确性。综上所述，亟需一种简便准确的制作单细胞测序参考品的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种。利用口腔上皮细胞制作单细胞测序参考品的方法，包括以下步骤：a)口腔上皮细胞获得、保存：刮取口腔上皮细胞，保存在PBS溶液中；b)分离单个口腔上皮细胞：在显微镜下，用毛细口吸管吸取单个口腔上皮细胞；c)单细胞全基因组扩增：对单细胞样本进行全基因组扩增，扩增后的样本用磁珠法纯化DNA；d)DNA片段化：对扩增样本进行酶切，用EDTA终止实验，然后用磁珠法纯化酶切产物；e)Proton文库构建：用DNA酶切后的产物进行文库构建，DNA片段末端补平后纯化，两端加特异性接头后纯化，PCR扩增后纯化；f)Proton半导体高通量测序平台进行上机测序：计算文库的稀释倍数，利用乳液PCR技术形成达到测序要求的阳性测序模板，利用半导体测序系统对测序模板进行测序，最终获得每个DNA片段的碱基序列；g)测序数据分析：将测序结果利用生物信息学分析把这些序列定位到人类基因组参考图谱上，通过与参考基因组的对比分析样本的信息。步骤a)中，刮取口腔上皮细胞前先用凉开水漱口，保证刮取的细胞中不含有除口腔上皮细胞以外的其他成分。步骤a)中，刮取口腔上皮细胞时，用干净的牙签平贴口腔两侧颊部，轻轻刮取口腔上皮细胞，避免损伤口腔内壁。步骤b)中，在吸取单个口腔上皮细胞之前，根据PBS溶液中细胞的密度在培养皿上进行梯度稀释，从最后稀释的液体中吸取单个口腔上皮细胞。步骤b)中，用毛细口吸管吸取单个口腔上皮细胞时，先让毛细管插入干净的PBS溶液中使其自然虹吸结束后拿出再进行单个口腔上皮细胞的吸取。步骤e)中，所述的纯化是采用磁珠法纯化。本专利技术优点在于：本专利技术提供了一种单细胞相关研究的标准品制备新途径，能够精确地对单个口腔上皮细胞的基因组DNA进行测序分析，过程中无细胞外游离DNA及外源DNA污染，配合半导体高通量测序技术平台，即能标准化、流程化、方便快捷的建立单细胞相关研究标准品。口腔上皮细胞相对人体的绝大多数细胞具有表面积大、容易分辨的特点，用单个或微量口腔上皮细胞进行整个全基因组范围的研究，取材上更经济方便，避免了其它活体取材方式的创伤性，用单个口腔上皮细胞建立单细胞研究和检测标准品，对于临床试管婴儿胚胎植入前遗传学筛查、肿瘤研究和治疗、单细胞的组学研究等具有重大意义。附图说明图1人口腔上皮细胞染色图。图2单细胞扩增结果电泳图。图3单细胞基因组文库构建片段分析图。图4人口腔上皮细胞单细胞测序数据分析。具体实施方式下面结合附图对本专利技术提供的具体实施方式作详细说明。对24例健康人员口腔上皮细胞分别分得单细胞，从每个人的口腔上皮细胞中取得8个单细胞样本，其中包括一个阴性对照。通过电泳分析和测序结果比对分析等方法，以证实对人口腔上皮细胞的单细胞进行扩增和测序来建立人单细胞相关实验研究标准品的可行性。1.人口腔上皮细胞获得、保存细胞捐献者先用凉开水漱口，去除口腔中的食物残渣，保证刮取的细胞中不含有除人口腔上皮细胞以外的其他成分。用干净的牙签平贴口腔两侧颊部，轻轻刮取口腔上皮细胞，避免损伤口腔内壁，然后将粘有口腔上皮细胞的牙签的一端在1×PBS溶液中反复蘸几下，使细胞分散到PBS溶液中，透过光线可以看到散布在PBS溶液中的微小的白色固形物即为人的口腔上皮细胞。取完细胞后，可以立即用于后续试验，也可以在4摄氏度冰箱中短时间放置。2.分离单个人口腔上皮细胞为了进一步保证口腔上皮细胞的清洁无污染状态，可以对装有样本的PCR管进行低速离心，去掉上清液，再向其中加入100μL 1×PBS溶本文档来自技高网...

【技术保护点】
利用口腔上皮细胞制作单细胞测序参考品的方法，其特征在于，包括以下步骤：a)口腔上皮细胞获得、保存：刮取口腔上皮细胞，保存在PBS溶液中；b)分离单个口腔上皮细胞：在显微镜下，用毛细口吸管吸取单个口腔上皮细胞；c)单细胞全基因组扩增：对单细胞样本进行全基因组扩增，扩增后的样本用磁珠法纯化DNA；d)DNA片段化：对扩增样本进行酶切，用EDTA终止实验，然后用磁珠法纯化酶切产物；e)Proton文库构建：用DNA酶切后的产物进行文库构建，DNA片段末端补平后纯化，两端加特异性接头后纯化，PCR扩增后纯化；f)Proton半导体高通量测序平台进行上机测序：计算文库的稀释倍数，利用乳液PCR技术形成达到测序要求的阳性测序模板，利用半导体测序系统对测序模板进行测序，最终获得每个DNA片段的碱基序列；g)测序数据分析：将测序结果利用生物信息学分析把这些序列定位到人类基因组参考图谱上，通过与参考基因组的对比分析样本的信息。

【技术特征摘要】
1.利用口腔上皮细胞制作单细胞测序参考品的方法，其特征在于，包括以
下步骤：
a)口腔上皮细胞获得、保存：刮取口腔上皮细胞，保存在PBS溶液中；
b)分离单个口腔上皮细胞：在显微镜下，用毛细口吸管吸取单个口腔上
皮细胞；
c)单细胞全基因组扩增：对单细胞样本进行全基因组扩增，扩增后的样
本用磁珠法纯化DNA；
d)DNA片段化：对扩增样本进行酶切，用EDTA终止实验，然后用磁珠
法纯化酶切产物；
e)Proton文库构建：用DNA酶切后的产物进行文库构建，DNA片段末
端补平后纯化，两端加特异性接头后纯化，PCR扩增后纯化；
f)Proton半导体高通量测序平台进行上机测序：计算文库的稀释倍数，利
用乳液PCR技术形成达到测序要求的阳性测序模板，利用半导体测序系统对
测序模板进行测序，最终获得每个DNA片段的碱基序列；
g)测序数据分析：将测序结果利用生物信息学分析把这些序列定位到人
类...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁波，孔令印，申静静，刘慧敏，孙丹凤，
申请(专利权)人：赛业健康研究中心太仓有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32