本发明专利技术公开了一种利用转录组测序的SSR分子标记鉴定马尾松种质的方法，其特征在于：包含以下步骤：(1)DNA提取采用天根DNAsecure Plant Kit试剂盒优化步骤，然后按如下的PCR反应体系和反应程序用引物对马尾松样本进行扩增；(2)基于马尾松转录组测序的序列设计SSR引物，并进行PCR扩增体系优化；(3)最后对PCR产物，采用优化的10％聚丙烯酰胺变性凝胶电泳，通过银染法对PCR产物进行检测，根据谱带的有无和大小来判定结果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，涉及基于马尾松转录组测序序列而开发的SSR引物及其应用。基于转录组序列开发的多对SSR标记引物，专用于从DNA水平对马尾松种质进行快速鉴定及亲缘关系分析。
技术介绍
马尾松(Pinusmassoniana)是我国南方最主要的优质针叶用材树种之一，在我国森林资源发展、林纸一体化、松香林产化工业及森林生态服务功能中具有重要地位，其中，马尾松优良种质的发掘和保护对产业的健康发展至关重要。因此，马尾松种质的准确、高效鉴定和亲缘关系分析，对种质的知识产权保护、开发和利用具有重要现实意义。目前，已有马尾松遗传多样性、遗传连锁图谱构建等方面的相关报道，但由于马尾松基因组及转录组数据的缺乏，造成马尾松生长发育规律解析、分子标记开发和遗传图谱构建等相对滞后。随着分子生物学的发展，，主要有RAPD、AFLP、ISSR、SRAP等分子标记技术已被用于马尾松种质鉴定、亲缘关系分析和遗传图谱构建，但这些多为显性标记，不能区分纯合体和杂合体，且这些分子标记覆盖马尾松基因组的比例较小，标记密度较低。简单重复序列(SSR)广泛分布于各类真核生物基因组的不同位置，由于重复次数和重复程度不同，使其呈现高度的多态性。与其它分子标记技术相比，SSR标记具有多态信息含量高、共显性遗传、技术简单、重复性好、特异性强等特点，被认为是可靠性最高的分子标记类型之一。SSR标记可分为基因组SSR(gSSR)和表达序列标签SSR(EST-SSR)，基因组SSR标记的开发操作繁琐，费时费力，费用高，这是限制SSR标记应用的一大瓶颈。与基因组SSR标记相比，表达序列标签来源于基因的转录区，可直接反映基因的表达信息，且标记在种间的通用性更高。随着高通量测序技术的快速发展和测序成本的降低，利用新一代高通量测序技术对植物全基因组范围内进行测序，产生丰富的转录组数据，其中包含了大量的EST序列。利用转录组序列开发SSR标记既有EST-SSR标记的优点，同时其海量的数据为SSR标记的开发提供了比EST-SSR更全面的信息，提高了遗传多样性和分子标记辅助育种研究的准确性。因此，本专利技术利用高通量测序技术成功获得马尾松转录组数据，对这些数据进行系统分析，最终找到了适用于马尾松SSR标记分析的引物，这将会对马尾松重要性状基因的定位、分子标记辅助选择育种和比较基因组学研究等起重要推动作用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是：为了克服现有分子标记覆盖马尾松基因组比例低、操作复杂等缺点，本专利技术旨在提供多态性检出率高、分辨率更好、稳定可靠、简单高效的分子标记鉴定方法。该方法可直接用于马尾松的种质鉴定、亲缘关系分析和遗传图谱的构建，为种质知识产权保护和遗传改良提供更好的评估工具。本专利技术需要解决的关键技术是马尾松SSR标记引物的获得，以及聚丙烯酰胺变性凝胶的优化。本专利技术的技术方案是：一种利用转录组测序的SSR分子标记鉴定马尾松种质的方法，包含以下步骤：(1)DNA提取采用天根DNAsecurePlantKit试剂盒优化步骤，然后按如下的PCR反应体系和反应程序用引物对马尾松样本进行扩增；(2)基于马尾松转录组测序的序列设计SSR引物，并进行PCR扩增体系优化；(3)最后对PCR产物，采用优化的10％聚丙烯酰胺变性凝胶电泳，通过银染法对PCR产物进行检测，根据谱带的有无和大小来判定结果。所述的SSR标记引物为如下的1对或任意几对：所述的PCR反应体系采用10-20μl反应体系：分别包含10-50ng的模板DNA1-2μl，正、反向引物各0.3-0.6μl，5-10μlMix及适量ddH2O。其中Mix含0.1U/μlTaqpolymerase、500μMdNTP、20mMTris-HCl、100mMKCl、3mMMgCl2，以及其它稳定剂和增强剂。所述的PCR的反应程序为：94℃预变性4min；对94℃反应30s，60-63℃反应45s，72℃反应45s进行40个循环；72℃延伸7min；4℃最终保存。本专利技术的有益效果：本专利技术方法适用于马尾松种质快速可靠的分子检测和鉴定，具有重要的实用价值，与其它方法相比，本专利技术具有以下的技术优势：1、操作简便快速：本专利技术对样本进行简单处理、PCR扩增和常规的聚丙烯酰胺变性凝胶电泳后即可判断结果，无需对扩增的产物进行限制性内切酶酶切，整个检测过程可在5个小时内完成；2、对聚丙烯酰胺变性凝胶的制作已进行优化，并形成一套完整的体系，效果较好：制作过程简单，耗时较短，且能将差异较小的片段(3bp左右)较好的区分开，进一步提高了SSR标记在种质鉴定和知识产权保护上的应用效率；3、检测结果灵敏度高：对待检样品仅需提供模板10-50ng，即可准确鉴定其所属种质；4、结果高度准确、可靠、重复性好：本专利技术已经对不同种质的马尾松DNA样本进行了检测，经过多次重复检测，检测准确率100％，为检测结果提供了高度的可靠性；5、本专利技术的SSR引物开发基于马尾松转录组测序结果，引物具有高特异性、专一性：在马尾松SSR分子标记研究领域，前人多采用从其他松属类植物中筛选的引物，或依靠生物信息学手段从松属EST数据库中开发的SSR引物，但效果都不太理想；6、本专利技术中开发的SSR引物获得的分子标记，在马尾松基因组中分布均匀、多态性丰富、清晰稳定、分辨率高，可有效用于马尾松的种质鉴定、亲缘关系分析及遗传图谱构建等工作，在知识产权保护和遗传育种上具有重要实际意义；7、取材方便、经济效益明显：针叶、球花等组织或器官均可为实验材料，苗期、幼林期、成年大树均可取样，不受季节、地点的限制。通过对马尾松苗木纯度的SSR分子鉴定，可避免苗木生产与销售过程中出现的鱼龙混杂现象。附图说明图1为SSR引物扩增后1％琼脂糖凝胶电泳初筛检测图；1～4分别表示福建漳平G22家系、H90家系、70-80-5家系；5、6分别表示广西南宁29-1家系、1-2-1家系；M为DNAMarker；图2为SSR引物扩增后10％聚丙烯酰胺变性凝胶电泳复筛检测图；1～6分别表示都匀林场的黄平49家系、黄平50家系、黄平38家系、福泉4家系、黄平34家系、福泉3家系；M为DNAMarker；图3为引物对PmS54对来自贵州、福建及广西共72份马尾松种质的10％PAGE变性凝胶电泳检测图；1～24对应表2中贵州都匀林场各家系；25～48对应表2中福建漳平林场各家系；49～72对应表2中广西南宁林场各家系；M为DNAMarker。具体实施方式实施例1：以本专利技术中的SSR引物，鉴定贵州、福建、广西三地共72份马尾松种质，其中以引物对PmS54为例，可区分供试材料。1.SSR引物的设计及合成首先对测序得到的序列进行前处理，得到高质量无冗余的EST序列，利用MISA软件在转录数据中搜索SSR位点，搜索标准为：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的最少重复次数分别为10、6、5、5、5和5，接着用Primer3.0引物批量设计程序对含有SSR位点的Unigene序列设计引物，并且SSR位点序列长度在18～27bp之间。其中，引物设计的主要参数为：退火温度(Tm)在57～63℃之间，60℃最佳；PCR产物大小为100～300bp；GC含量在40％～60％之间，50％最佳。引物由上海生工本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用转录组测序的SSR分子标记鉴定马尾松种质的方法，其特征在于：包含以下步骤：(1)DNA提取采用天根DNAsecure Plant Kit试剂盒优化步骤，然后按如下的PCR反应体系和反应程序用引物对马尾松样本进行扩增；(2)基于马尾松转录组测序的序列设计SSR引物，并进行PCR扩增体系优化；(3)最后对PCR产物，采用优化的10％聚丙烯酰胺变性凝胶电泳，通过银染法对PCR产物进行检测，根据谱带的有无和大小来判定结果。
【技术特征摘要】
1.一种利用转录组测序的SSR分子标记鉴定马尾松种质的方法，其特征在于：包含以下步骤：(1)DNA提取采用天根DNAsecurePlantKit试剂盒优化步骤，然后按如下的PCR反应体系和反应程序用引物对马尾松样本进行扩增；(2)基于马尾松转录组测序的序列设计SSR引物，并进行PCR扩增体系优化；(3)最后对PCR产物，采用优化的10％聚丙烯酰胺变性凝胶电泳，通过银染法对PCR产物进行检测，根据谱带的有无和大小来判定结果。2.根据权利要求1所述的一种利用转录组测序的SSR分子标记鉴定马尾松种质的方法，其特征在于：SSR标记引物为如下的1对或任意几对：3.根据权利要求1所述的一种利用转录组测序的SSR...
【专利技术属性】
技术研发人员：文晓鹏，梅利那，范付华，崔博文，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：贵州;52
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