一种抗肿瘤药物筛选细胞模型及其应用制造技术

一种抗肿瘤药物筛选细胞模型及其应用，属于生物工程技术领域。抗肿瘤药物筛选细胞模型是从胶质母细胞瘤中分离的、定点整合了报告基因的肿瘤干细胞，含有A－B－C－D结构的DNA构建物，其中：A，D为胶质母细胞瘤干细胞分子标记基因启动子及下游序列，B为报告基因序列，C为嘌呤霉素抗性基因puro序列；胶质母细胞瘤干胞分子标记基因是包括Nestin基因；报告基因包括绿色荧光蛋白基因GFP、或红色荧光蛋白基因RFP、及荧光素酶报告基因luciferase。该抗肿瘤药物的细胞模型用于筛选细胞毒性和诱导分化的物质。有益效果在于：1、避免了传统的细胞转基因方法的不利影响，检测结果将能正确反映药物作用效果。2、获得抗肿瘤干细胞的化合物。

【技术实现步骤摘要】
一种抗肿瘤药物筛选细胞模型及其应用
：本专利技术涉及一种抗肿瘤药物筛选细胞模型及其应用，属于生物工程

技术介绍
：癌症干细胞具有与组织干细胞类似的分子标记、自我更新和分化功能，在移植后能重现原癌症的组织学、分子生物学等特征，耐常规放疗和化疗，是癌症发生、复发和转移的主要原因，因此癌症干细胞正成为癌症研究的重要领域和癌症治疗的主要靶标。但目前的抗肿瘤药物主要用癌症细胞系筛选获得，缺乏针对肿瘤干细胞的药物，也缺乏良好的基于肿瘤干细胞的药物筛选模型。胶质母细胞瘤是最常见的脑肿瘤，恶性程度极高。随着癌症研究的进展，大部分癌症的治愈率和生存期都获得了明显改善，但胶质母细胞瘤病人的生存期在过去几十年中没有显著改观，平均仅约1年，迫切需要研发新的治疗药物。胶质母细胞瘤干细胞是最早确定的实体瘤干细胞之一，也是为数不多的在体外能稳定长期培养的肿瘤干细胞之一，为利用胶质母细胞瘤干细胞进行药物筛选奠定了基础。药物筛选模型是寻找和发现新药物的重要条件之一。目前抗肿瘤药物的筛选方法主要在包括体内和体外筛选方法，体内筛选方法成本高，操作难度大，不利于高通量的药物筛选；体外筛选方法主要是在分子和细胞水平上实现的，具有材料用量少，作用机制明确，易用于大规模筛选等优点，是药物筛选的主要方法。药物筛选细胞模型常用报告基因随机插入建立稳定细胞株，控制外源标记基因表达的启动子活性常受到整合位点附件基因组DNA的影响，因此标记基因的变化并不能完全反映内源基因的变化，影响药效的评价。综上所述，有必要建立良好的基于胶质母细胞瘤干细胞的抗肿瘤药物筛选模型。
技术实现思路
：本专利技术针对现有抗肿瘤药物筛选技术存在的不足，提供一种简便、快速、直接、经济的抗肿瘤药物筛选细胞模型及其建立方法和应用。本专利技术的抗肿瘤药物的细胞模型，是从胶质母细胞瘤中分离的，定点整合了报告基因的肿瘤干细胞，含有A－B－C－D结构的DNA构建物，其中：A，D为胶质母细胞瘤干细胞分子标记基因启动子及下游序列，B为报告基因序列，C为嘌呤霉素抗性基因puro序列；胶质母细胞瘤干胞分子标记基因是但不限于Nestin基因；报告基因为但不限于绿色荧光蛋白基因EGFP，或YFP、RFP荧光蛋白，或荧光素酶luciferase。本专利技术的抗肿瘤药物筛选细胞模型的构建方法，运用同源重组技术，将报告基因绿色荧光蛋白EGFP定点整合至肿瘤干细胞分子标记基因Nestin启动子下游，建立药物的细胞毒性和分化诱导筛选平台。本专利技术的抗肿瘤药物的细胞模型用于筛选抗肿瘤干细胞的细胞毒性和诱导分化的物质(如小分子化合物、多肽)。即：将候选物质加入上述的培养细胞中，用高内涵设备或荧光显微镜检测药物组中报告基因的表达，并与对照组比较，所述对照组是不添加候选物质的上述细胞。如果测试组中报告基因表达细胞数低于对照组，就表明候选物质能够抑制肿瘤干细胞增殖或诱导细胞凋亡；如果单个细胞中报告基因表达水平降低则说明候选物质能够诱导肿瘤干细胞分化。本专利技术的抗肿瘤药物的细胞模型还能对筛选出的抗肿瘤干细胞物质进行进一步的细胞/动物实验，以确定这些物质在抗肿瘤药物研发中的前景。本专利技术的有益效果在于：1、避免了多拷贝转基因所致的基因组不稳定性、转基因插入会破坏内源基因、转基因所用启动子受插入位点两侧序列影响不能完全反映启动子活性变化的不利影响，检测结果将能正确反映药物作用效果。2、具有简便、快速、直接、经济的优点。附图说明：图1是将EGFP定点整合至nestin启动子下游的打靶示意图。图2-a和图2-b显示腺病毒感染肿瘤干细胞后荧光观察结果。图3-a和图3-b显示腺病毒感染肿瘤干细胞后PCR检测阳性克隆细胞。具体实施方式：下面结合附图和实施例，进一步阐述本专利技术。下列实施例中未注明具体的实验方法，通常按照常规条件如分子克隆实验指南(sambrook,J.)中所述的方法，或按照实验所用试剂或仪器说明书建议方法。一、构建物及载体所述构建物从5’端到3’端依次含有nestin启动子序列，报告基因序列，内部核糖体进入位点序列(IRES)或者自剪切2A肽序列,嘌呤霉素抗性基因序列(puro)，转录终止信号序列(polyA)和nestin启动子下游序列。所述的报告基因包括：绿色荧光蛋白(GFP)基因、红色荧光蛋白(RFP)基因或者荧光素酶基因(luciferase)。GFP作为一种标记蛋白，其内源荧光基团在受到蓝光激发时能高效发射清晰可见的绿光。所述的GFP还包括在野生型GFP基础上进行改进的蛋白，例如进行基因优化(如去除隐蔽性内含子)；或通过氨基酸替换提高GFP脱辅基蛋白在高温条件下的正确折叠，以及改变GFP光谱特性。在本专利技术中，所述的GFP是增强型的绿色荧光蛋白(EGFP)，EGFP为对绿色荧光蛋白进行改进后的蛋白，与GFP具有很高的同源性，在表达后发光的效果更为理想。红色荧光蛋白(RFP)是从珊瑚虫中克隆的一种与绿色荧光蛋白(GFP)同源的荧光蛋白，在紫外光的照射下会发出红色的荧光。与GFP相比，RFP具有激发和发射波长更长，细胞内成像背景更低的优点，但同时也有寡聚化、成熟缓慢的限制。所述的RFP还包括在野生型RFP基础上进行改进的蛋白，例如dsRed,mKate2。所述的“荧光素酶报告基因”系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。它具有以下优点：1.内源性低，哺乳动物无内源性的荧光素酶表达；2.灵敏度高，荧光素酶介导的化学发光反应效率高，发光强，易于检测；3.检测范围广，幅度跨越大于107；4.经济实惠，并且重复性好。所述的内部核糖体进入位点(IRES)是一段核酸序列，当这段核酸序列被翻译为RNA时，能折叠成类似于起始tRNA的结构，从而介导核糖体与RNA结合，起始下游蛋白质序列的翻译。在本构建物中IRES位于绿色荧光蛋白序列和嘌呤霉素抗性基因序列之间，绿色荧光蛋白靠5’帽子结构起始翻译，而嘌呤霉素则依靠IRES起始翻译。因此嘌呤霉素和EGFP的表达受同一启动子驱动。所述的自剪切2A肽源于口蹄疫病毒，是近年使用较多的一种构建多基因载体的工具。研究指出,通过串联方式将2A肽和基因置于同一个开放读码框中能够实现在同一启动子的调控下表达多个基因。所述的“启动子”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游，能够引导核酸序列转录为mRNA.本专利技术所述的nestin启动子序列为肿瘤干细胞/神经干细胞内特异性启动子，因此由其驱动表达的EGFP及其puro仅在肿瘤干细胞/神经干细胞内表达。所述的“转录终止信号序列”是指在结构基因DNA分子中用于终止转录作用的元件，又称终止子；终止子有一段GC富集区，随后又有一段AT富集区。在GC富集区内有一段反向重复序列，以致转录作用生成的mRNA在其相应序列中有互补形成的发卡结构。作为本专利技术的优选方式，所述的报告基因是EGFP，在不裂解细胞的情况下，能通过显微镜直接观察到细胞内EGFP的表达情况，从而判断细胞存活、生长的变化以及细胞分化情况。作为本专利技术的特别优选的方式，所述的构建物中，在报告基因的下游，还包括嘌呤霉素抗性基因Puro序列。当外源基因进入细胞后，发生同源重组的概率非常小，故常常运用抗生素选择标记来筛选整合了目的基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗肿瘤药物筛选细胞模型，其特征在于该抗肿瘤药物筛选细胞模型是从胶质母细胞瘤中分离的、定点整合了报告基因的肿瘤干细胞，含有A－B－C－D结构的DNA构建物，其中：A，D为胶质母细胞瘤干细胞分子标记基因启动子及下游序列，B为报告基因序列，C为嘌呤霉素抗性基因puro序列；胶质母细胞瘤干胞分子标记基因包括Nestin基因；报告基因包括绿色荧光蛋白基因GFP、或红色荧光蛋白基因RFP、或者荧光素酶报告基因luciferase。

【技术特征摘要】
1.一种抗肿瘤药物筛选细胞模型，其特征在于该抗肿瘤药物筛选细胞模型是从胶质母细胞瘤中分离的、定点整合了报告基因的肿瘤干细胞，含有A－B－C－D结构的DNA构建物，其中：A，D为胶质母细胞瘤干细胞分子标记基因启动子及下游序列，B为报告基因序列，C为嘌呤霉素抗性基因puro序列；胶质母细胞瘤干细胞分子标记基因是Nestin基因；报告基因包括绿色荧光蛋白基因GFP、或红色荧光蛋白基因RFP、或荧光素酶报告基因luciferase；该抗肿瘤药物筛选细胞模型经如下步骤得到：a.将报告基因序列连接到pENTR-u6载体上，获得包含报告基因序列的LR重组入门载体；b.将IRES序列或者2A肽序列连接到(a)获得的载体上，IRES或者2A肽序列位于报告基因终止密码子之后；c.将嘌呤霉素抗性基因puro连接到(b)获得的载体上，puro基因序列位于IRES或者2A肽序列序列下游，与报告基因一同受nestin启动子驱动，用于同源重组阳性细胞的筛选；d.将nestin启动子序列连接到(c)获得的载体上，nestin启动子序列位于报告基因上游，作为同源重组时的所需的5′...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵旭东，杨东，代智，王路，
申请(专利权)人：中国科学院昆明动物研究所，
类型：发明
国别省市：云南;53