本发明专利技术属于药物和细胞生物学领域，涉及一种以人趋化因子受体4为靶标的高效、可靠的CCR4拮抗剂的高内涵筛选细胞模型及筛选方法。本发明专利技术建立了一种导入了人CCR4-增强型绿色荧光蛋白融合表达的细胞系，经人胸腺激活调节趋化因子、巨噬细胞衍生的趋化因子激动，诱发带有绿色荧光蛋白的CCR4发生重新分布，形成绿色荧光颗粒，建立了适于高内涵筛选的CCR4拮抗剂的细胞模型。使用该模型通过测定被筛选化合物激动或抑制CCR4的绿色荧光颗粒的形成来评价化合物的生物活性。本发明专利技术所建立的药物筛选模型是一种灵敏、高效、可靠、适用于高通量、高内涵筛选的CCR4拮抗剂的细胞模型及其筛选方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于药物和细胞生物学领域，涉及一种CCR4拮抗剂的高通量筛选细胞模 型及其建立方法与应用，特别涉及基于CCR4的高内涵筛选CCR4拮抗剂细胞模型及其建立 方法与应用。
技术介绍
药物筛选模型是药物研发必不可少的药物活性研究平台。高内涵分析技术能在 保持细胞结构和功能完整性的前提下，同时检测被测样品对细胞形态、生长、分化、迁移、凋 亡、代谢途径及信号转导各个环节的影响，在获得生物活性信息的同时能够观察的测试样 品相关的毒性信息。因此，引入高内涵筛选技术是创新药物筛选研究的趋势。CCR4(chemokinereceptor4，CCR4)是一种由CCR4基因编码的G蛋白偶联受体， 属于CC类趋化因子受体（CCR)家族成员之一。据报道，CCR4在变应原引发的Th2细胞的募 集，归巢和活化过程中起着重要作用。Th2细胞可分泌多种细胞因子如IL-4、IL-5和IL-13， 刺激炎症细胞的活化，进而影响多种过敏性疾病的发生和发展，如过敏性气道疾病（哮喘、 过敏性鼻炎）。CCR4拮抗剂能够抑制CCR4与配体的结合，阻断受体介导的细胞信号通路，因 此，靶向CCR4发展抗过敏性鼻炎等过敏性疾病的治疗药物，已成为新药研发的重要方向。 目前，CCR4拮抗剂的高通量筛选方法主要有基于特定人工细胞的细胞钙 流测定，包括CCR4-HEK_Gqi5 细胞系（Andrews,G.，C.Jones,andK.A.Wreggett,An IntracellularAllostericSiteforaSpecificClassofAntagonistsoftheCCChemokine GProtein-CoupledReceptorsCCR4andCCR5.MolecularPharmacology, 2007. 73(3):p. 855-867)、CCR4-CH0-Gqi5a细胞系（YasuhiroNAKAGAMI,a,etal.，RS-1748,aNovelCC ChemokineReceptor4Antagonist,InhibitsOvalbumin-InducedAirwayInflammation inGuineaPigs.Biol.Pharm.Bull.，2010. 33(6) :p. 1067-1069)、CCR4-CH0-Gal6 细胞 系(DouglasF.Burdi,S.C. ,KarenMattia,CelesteHarrington,ZhanShi, ,etal. ,Small moleculeantagonistsoftheCCchemokinereceptor4(CCR4).Bioorganic&Medicinal ChemistryLetters2007. 17:p. 3141 - 3145)。虽然钙流检测在CCR4拮抗剂的筛选中应用非 常广泛，但该模型是将人工修饰的复合式/嵌合式Gai/q导入CCR4表达细胞，使CCR4由 Gai介导信号通路转变为Gaq介导的调控胞内钙流的信号通路。还有基于CCR4-CH0 细胞系（YasuhiroNAKAGAMI,a,etal·，RS-1748,aNovelCC ChemokineReceptor4Antagonist,InhibitsOvalbumin-InducedAirwayInflammationin GuineaPigs.Biol.Pharm.Bull. ,2010. 33 (6) :p. 1067-1069)的GTPyS结合试验。但 是，该分析方法需要特定的过滤装置和步骤来分离游离的和结合的GTPγS，这就限制 了该分析方法的通量，此外，值得注意的是，该分析方法涉及放射性物质，安全性较低，不是 未来发展的方向。 通过cAMP分析筛选G as偶联受体的激动剂或拮抗剂通常是很容易的，而筛选如 CCR4样的Gai偶联受体的配基，特别是拮抗剂却比较困难。不拘于理论的限制，原因之一 在于需要用forskolin(福司柯林，腺苷酸环化酶的直接激活剂）预刺激AC的活化，然后使 用受体激动剂（TARC或者MDC)抑制被forskolin激活的AC，然后才能检测拮抗剂产生的与 激动剂相反的作用，需要较多的优化步骤，且测试窗口比较小。此外，还有CCR4_HEk293 细胞系（Qi，H.，etal.，Anantagonistfor CCR4alleviatesmurineallergicrhinitisbyintranasaladministration.IntArch AllergyImmunol,2012.159 (3):p. 297-305)Hut78 细胞系（Sato,T.，etal.，Inhibitory effectoftheneworallyactiveCCR4antagonistK327onCCR4+CD4+Tcellmigration intothelungofmicewithovalbumin-inducedlungallergicinflammation.Pharmacolo gy，2009. 84(3) :p. 171-82)的细胞趋化实验，但该种方法操作繁复，不适合高通量。 因此，亟需开发新的能够高效筛选CCR4拮抗剂的模型。
技术实现思路
本专利技术人经过深入的研究和创造性的劳动，建立了一种能够稳定表达CCR4-EGFP 融合蛋白的细胞，以及一种基于CCR4-EGFP融合蛋白的绿色荧光颗粒的形成来检测CCR4受 到激活或抑制（拮抗）的方法，可用于高通量、高内涵的药物（CCR4拮抗剂）筛选，并能够 通过细胞核数量、形态的分析，鉴别化合物因毒性产生的对受体的非特异性影响，确保筛选 出的拮抗剂具有受体的特异性作用。由此提供了下述专利技术： 本专利技术的一个方面涉及一种细胞，其同时表达CCR4蛋白和报告基因蛋白。 根据本专利技术任一项所述的细胞，其特征在于如下的（1) 一（3)项中的任意一项或 者多项： ⑴所述CCR4为人源；具体地，所述CCR4蛋白的序列为SEQIDN0 :1 ; (2)所述报告基因蛋白为EGFP蛋白；具体地，所述EGFP蛋白的序列为SEQIDNO: 3 ； (3)所述细胞为人源细胞，具体地，为体外培养的人源细胞；具体地，为人骨瘤细 胞；更具体地，为人骨肉瘤U20S细胞。 在本专利技术的一个实施方案中，CCR4蛋白的序列如下（360aa): CCR4蛋白的编码序列如下（1083bp): 本专利技术中，EGFP(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)蛋白是增强型绿色 荧光蛋白，属于一种报告基因蛋白。 EGFP的蛋白序列如下（239aa): EGFP的编码基因序列如下（720bp): 在宿主细胞选择上，本专利技术人曾尝试了多种G蛋白偶联受体常用的表达细胞，例 如HEK293XH0和U20S，但均未能获得稳定表达CCR4-EGFP融合蛋白的HEK293XH0细胞克 隆（实验数据和照片未保留），最终选择U20S作为母细胞。不拘于理论的限制，该细胞为 人源细胞系，相对CH0具有更完善的下游信号通路，受体可正常激活；贴壁细胞相对HEK293 更易操作，细胞较大有利于高内涵成像和分析，转染效率相对较高，适合本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种细胞，其同时表达CCR4蛋白和报告基因蛋白。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王莉莉，李微，戴文婕，龙隆，肖军海，陈伟，李松，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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