本发明专利技术公开了一种细胞模型及其构建方法和在筛选抗神经紊乱性疾病药物中的应用，属于基因工程及分子药理学技术领域。本发明专利技术的细胞模型是携带并能表达mGluR2基因的哺乳动物细胞。该细胞模型的构建方法是将mGluR2基因与表达载体连接构建成重组质粒后导入哺乳动物细胞，经过筛选培养获得能稳定表达mGluR2基因的细胞株。该细胞模型可用于筛选抗神经紊乱性疾病药物，通过将待筛选物质加入到细胞模型培养基中，测定应答元件的产量或被激活程度来判断该物质是否被筛出。本发明专利技术的细胞模型能够高通量、低成本且准确地筛选抗神经紊乱性疾病药物，筛选方法步骤简单可控，成本低廉，通量高，具有很好的稳定性和可靠性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程及分子药理学
，具体涉及一种能够筛选以mGluR2为靶点的抗神经系统疾病药物的细胞模型及其构建方法，和该细胞模型在筛选抗神经紊乱性疾病药物中的应用。
技术介绍
现代社会随着环境污染和生活压力的日益加重，精神类疾病和神经性疾病，特别是神经退行性疾病越来越多地困扰着人类。最新公布的《世界卫生报告》指出目前，神经退行性疾病及其精神类疾病已成为人类的大敌。从全球范围来看,神经退行性疾病帕金森氏症患者就约有500万人，仅仅是在中国，患者已超过200多万人。因此针对精神类疾病以及神经退行性疾病的新药创制已经被列入国家重点发展战略。也成为全球各大药物研发公 司关注的焦点。C族GPCR成员因为其独特的生理功能成为精神类疾病以及神经退行性疾病药物研发焦点中的焦点。C族GPCR成员包括代谢型Y-氨基丁酸受体(GABABR)、代谢型谷氨酸受体(mGluRl-8)、钙敏感性受体(CaSR)以及味觉受体，该家族受体在体内参与很多重要的生理进程，过度激活或抑制都会引起癫痫、精神分裂症、亨庭顿症、帕金森症、药物依赖性、疼痛等神经紊乱性疾病的病理发生。功能上的重要性和结构上的易操控性，使得该家族成员成为重要的药物作用靶点，也成为各大药物公司研发的重点，有着潜在的极高的科研和市场价值。截止到2005年，根据IMS Health做出的相应统计，现在销售的药物中与GPCR有关的抗精神病药，销售额已达到476亿美元，并保持强劲的增长速度。mGluR2是中枢神经系统中的一个重要受体，属于C族GPCR，与mGluR3 —起被归为mGluR亚族IKGroup II mGluRs)。mGluR2是位于细胞膜上的跨膜受体，是一种重要的G蛋白偶联受体。其活化状态失调会引起下游信号通路激活紊乱，从而引起一系列精神紊乱性疾病的发生。mGluR2是一个同源二聚体，广泛分布于大脑皮层，嗅前核，伏隔核，下丘脑，海马回等部位的细胞中。每个mGluR2包括两个胞外的VFT和两个跨膜HD结构域。当谷氨酸结合到正构位点或变构剂结合到变构位点，mGluR2被激活并与G i/o相耦联，被激活后会抑制腺苷酸环化酶进而抑制cAMP产生。通常情况下，mGluR2主要定位在突触前膜，抑制神经递质的释放，影响神经元的兴奋性和突触的传递，是治疗神经系统紊乱药物的理想靶标。目前这方面的研究尚处于起步阶段，以mGluR2为祀点的药物还未被用于临床。但是大量动物实验及临床前研究证明，mGluR2敲除模型及其他药理研究方法发现mGluR2在认知、药物成瘾及精神病等生理及病理过程中发挥重要作用。临床前及临床研究表明mGluRs亚族II是治疗焦虑及精神分裂症的潜在新型药物靶点，这一发现在焦虑及精神分裂症治疗史上具有里程碑意义，有可能最终推动mGluR亚族II的激动剂或PAMs成为治疗这两种疾病的基础治疗方案。此外，mGluR2的激动剂及阳性变构剂还可以治疗其他中枢神经系统疾病，包括疼痛、成瘾、抑郁及癫痫坐寸O基于细胞信号通路的高通量药物筛选(high throughput screening, HTS)是利用细胞信号系统作为应答元件，通过高灵敏度的数据采集系统和技术手段检测作为药物靶点的受体及各种蛋白所介导的细胞内信号事件，从而观测化合物是否能作用于药物靶点，进而找到具有靶点选择性的先导化合物。而分子与细胞水平的药物筛选模型具有材料用量少、药物作用机制明确等特点，已经成为目前寻找和发现新药物的主要药物筛选方法(FONNUM F. A rapid radio chemical method for the determination of cholineacetyl transferase . J Neurochem , 1975, 24 ( 2 ) : 407 - 409.)。将药物革巴点导入工具细胞，并构建稳定的重组高表达目标药物靶点的细胞筛选模型，是实现高通量药物筛选的关键环节。药物筛选模型是用于证明某种物质具有药理活性(生物活性、治疗作用)的实验方法，是寻找和发现新药物的重要条件之一。 目前，基于GPCR下游信号转导的高通量药物筛选方法学相对比较成熟，多家公司可提供高通量检测仪器及方案。药物筛选模型的发现和构建则成为制约和推动该领域发展的重要因素，尤其是基于受体分子机制的模型构建更是成为发现新型先导化合物的核心技术和难点。现有技术中还没有能够高通量筛选神经系统紊乱性疾病药物的细胞模型。
技术实现思路
针对现有技术中的上述不足，本专利技术建立了一种抗神经紊乱性疾病的筛选模型，它是一种能够稳定表达与神经系统疾病相关的GPCR-mGluR2，能够灵敏、特效地筛选以mGluR2为靶点的药物，包括激动剂、抑制剂和变构剂等。本专利技术提供的一种细胞模型，是携带并能表达mGluR2基因的哺乳动物细胞。即该细胞模型是克隆了表达编码人源mGluR2基因序列的体外培养的哺乳动物细胞。优选地，所述mGluR2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示。优选地，所述哺乳动物细胞为CHO细胞或HEK293细胞。其它哺乳动物细胞也能够实现本专利技术，而以CHO细胞或HEK293细胞构建效果最佳。优选地，该细胞模型的名称为中国仓鼠卵巢细胞CH0-hmGluR2(C12)，于2012年9月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: C2012100。保藏地址中国.武汉.武汉大学。本专利技术还提供了一种上述细胞模型的构建方法，步骤如下 (1)将mGluR2基因与表达载体连接，构建含有mGluR2基因的重组质粒； (2)将重组质粒转染哺乳动物细胞，培养成能稳定表达mGluR2基因的细胞株，该细胞株即为所述的细胞模型。上述细胞模型的构建方法，优选地，还包括对细胞株进行综合评估的步骤(3):在细胞株中加入mGluR2激动剂或抑制剂，测定下游信号应答反应，根据应答反应结果评估该细胞株是否作为细胞模型。所述测定下游信号应答反应包括检测mGluR2与其配体结合程度、mGluR2下游G蛋白与GTP YS结合程度、环腺苷酸积累量、三磷酸肌醇积累量和细胞内钙离子流变化量中的一种或几种。其中检测mGluR2与其配体结合程度以及G蛋白与GTPyS结合程度可以采用放射性结合实验。优选地，步骤(I)所述的表达载体为pcDNA5/FRT。优选地,步骤(2)使用的细胞为CHO细胞。例如可以使用Invitrogen商品化细胞系Flp-in CHO细胞，Flp-In细胞系经设计可快速构建稳定表达细胞系，以能够采用Flp-In表达载体表达目的蛋白。这些细胞在转录活跃区上含有一个稳定整合的重组酶识别序列(FRT)位点。Flp-In表达载体的定点整合可确保高表达量。用Flp-In表达载体和Flp重组酶载体P0G44共转染Flp-In细胞系，使得表达载体被定点整合在每个细胞的相同染色体位点上。上述细胞模型的构建方法，更优选地步骤(I)还包括对构建的重组质粒进行测序鉴定；步骤(2)所述的重组质粒转染哺乳动物细胞是将重组质粒与表达重组酶的质粒P0G44共导入哺乳动物细胞中，再利用潮霉素(Hygromycin)进行筛选，获得带有潮霉素抗性的单克隆细胞，继续培养后利用Western blot、测细胞中的cAMP或Ca2+流等本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种细胞模型，其特征在于，该细胞模型是携带并能表达mGluR2基因的哺乳动物细胞。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张文华，皮振钧，胡萍，孙兵，孟夏，刘剑峰，
申请(专利权)人：吉瑞泰武汉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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