一种干涉膨胀素基因Exp2制备植物悬浮培养小细胞系的方法技术

一种干涉膨胀素基因Exp2制备植物悬浮培养小细胞系的方法，本发明专利技术属于生物技术领域。首先，选定基因Exp2两个保守区分别为正向片段I、II以及对应的反向序列I’和II’；构建I-AC-II’-II-CT-I’的RNAi片段；并筛选出其插在pCAMBIA2300植物表达载体的根瘤农杆菌工程菌。然后，以甘草为例，农杆菌介导法依次获得转化的愈伤组织及其稳定表达的悬浮细胞。再次，通过看护培养，利用悬浮细胞，筛选生长速度快、效果好的单细胞系愈伤组织以及由此形成的悬浮细胞系。最后，通过培养工艺优化，获得悬浮细胞生长和产物积累的最佳发酵工艺参数。利用本发明专利技术方法获得的密度大、培养周期短、成本低、生产效率高的细胞系，为大规模开发和生产药用植物有效成分提供优质种源。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术专利属于生物

技术介绍
细胞悬浮培养是生产植物次生代谢物的重要手段之一。但是，植物悬浮细胞生长速度缓慢、培养周期长成了细胞悬浮培养的环节多、成本高等关键问题。本专利技术利用RNAi原理，通过降低植物Exp2基因的表达，以达到缩短植物悬浮细胞培养周期、提高细胞培养密度目的。
技术实现思路
构建植物细胞表达载体。通过比对Genbank注册的植物Exp2基因的核苷酸序列，选定其两个保守区各30-100个碱基对的核苷酸序列分别为正向片段I和II，并以其为依据分别设置其对应的反向序列(I’和II’ );根据两对正、反序列设计出合适的引物，在PCR扩增过程中，使正反片段分别引入限制性内切酶位点(EcoR I和Hind III)和相应的⑶-AG内含子端部序列。经过酶切、再连接、转化、克隆和鉴定后，得到了四片段的I-AC-II’ -II-CT-I’序列产物；该产物插入到PCAMBIA2300植物表达载体，导入农杆菌感受态EHA105，筛选出能转化植物的工程菌。以甘草为例获得甘草转化体。从甘草幼苗的上胚轴上诱导愈伤组织；早期愈伤组织与农杆菌工程菌共培养；随后在含抗生素的培养基中进行选择培养，筛选出抗性愈伤组织并进行继代培养；将松散的抗性愈伤组织在液体培养基振荡培养；培养物过筛后继续进行悬浮培养，获得稳定的悬浮细胞。高产悬浮细胞系的筛选。利用看护培养手段，从悬浮细胞中筛选生长速度快的单细胞系愈伤组织；将该愈伤组织在液体培养基中振荡培养；培养物过筛后继续进行悬浮培养，获得由单细胞和小细胞团组成的悬浮系；对该悬浮系的细胞生长周期、主要代谢产物含量进行等鉴定并稳定性试验，获得的生长悬浮细胞作为种子进入大规模。细胞悬浮培养基及培养条件的优化。通过培养基和培养条件的优化，获得植物细胞生长和产物积累的最适碳氮源、pH、温度、溶氧量和最佳接种量等发酵工艺参数，为进一步进行大规模细胞悬浮培养提供了依据。主要用途利用本专利技术方法获得的培养周期短、成本低、生产效率高的细胞，将在大规模开发和生产药用植物有效成分方面将发挥着关键作用。具体实施例方式以甘草为例-干涉膨胀素基因Exp2制备甘草悬浮培养小细胞系的方法构建植物细胞表达载体通过Genbank注册的所有植物膨胀素基因的核苷酸序列，选定其两个保守区各50个碱基对的核苷酸序列分别为正向片段I和II，并以其为依据分别设置其对应的反向序列(I’和II’ );根据两对正、反序列设计出合适的引物，在PCR扩增过程中，使正反片段分别引入限制性内切酶位点(EcoR I和Hind III)和相应的⑶-AG类内含子端部核苷酸序列。结果见表I。经过酶切、再连接、转化、克隆和鉴定后，得到了四片段的I-AC-II’ -II-CT-I’序列产物；该产物插入到PCAMBIA2300植物表达载体，导入感受态农杆菌EHA105，筛选出能转化植物细胞的工程菌pCAM-RNAi-Exp。 表I膨胀素基因两个保守片段及其PCR引物的核苷酸序列￥￥]核苷酸序列M 5 ’ -C ATCCGCCATTGTCGTTCGG AAGGGCG AAGTTCGG AGGGI^]正向核苷酸序列 CAGAAGTTGGTlGTTGCAGTI-35 5 ’ -IccaagaagIaccaacttctgccctccgaacttcgcccttccV --反向核苷酸序列 GAACGACAATGGCGGATG-35 5 ’ -TTCTTCTCTCTTTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTGGATTTAII__正向核苷酸序列 GACACGGA|GTTGCAGTl-3， 55-IccaagaagItccgtgtctaaatccaagaagaagaagaagaII’--反向核苷酸序列 AGAAGAA A AGAGAGA AGA A-35 P1GCAAGCTTCATCCGCCATTGTCG正向引物 I PrCGACAATGGCGGATGAAGCTTGC反向引物 I P11GTGAATTCTTCTTCTCTCTTTTCTT正向引物 11 PirAAGAAAAGAGAGAAGAAGAATTCAC反向引物 11注表的框中和下划线上核苷酸为非膨胀素基因的核苷酸序列。获得甘草细胞转化体从甘草幼苗的上胚轴上诱导愈伤组织；早期愈伤组织与农杆菌工程菌EHA105共培养；随后在含抗生素的培养基中进行选择培养；对形成的抗性愈伤组织进行GUS组织化学染色、抗性基因的PCR鉴定，结果见表2 ;对鉴定阳性的愈伤组织进行继代培养2-5次直至形成松散型愈伤组织；将松散的抗性愈伤组织在液体培养基中振荡培养；培养物过筛后继续进行悬浮培养，获得稳定的悬浮细胞系；对形成的悬浮细胞进行报告基因gus蛋白的组织化学染色、抗生素抗性基因的PCR鉴定，以确定其是否为转化的悬浮细胞系。表2不同浓度工程农杆菌对甘草愈伤组织转化率的影响本文档来自技高网...

【技术保护点】
构建膨胀素基因Exp2的RNAi表达载体工程菌。利用Genbank报道的膨胀素基因核苷酸序列，选择两段保守性较高的核苷酸区域分别作为正向片段(I和II)，并以其为依据分别设置其对应的反向序列(I’和II’)，通过比对Genbank注册的植物膨胀素基因Exp2的核苷酸序列，选定其两个保守区分别为正向片段I、II以及对应的反向序列I’和II’；构建I？AC？II’？II？CT？I’的RNAi片段；筛选出插在pCAMBIA2300表达载体并能转化植物细胞的工程菌。

【技术特征摘要】
1.一种干涉膨胀素基因Exp2制备植物悬浮培养小细胞系的方法。其特征是.1.构建膨胀素基因Exp2的RNAi表达载体工程菌。利用Genbank报道的膨胀素基因核苷酸序列，选择两段保守性较高的核苷酸区域分别作为正向片段(I和II)，并以其为依据分别设置其对应的反向序列(I’和II’)，通过比对Genbank注册的植物膨胀素基因Exp2的核苷酸序列，选定其两个保守区分别为正向片段Ι、Π以及对应的反向序列I’和II’ ；构建I-AC-II’ -II-CT-I’的RNAi片段；筛选出插在pCAMBIA2300表达载体并能转化植物细胞的工程菌。.2.从外植体诱导早期愈伤组织；早期愈伤组织与根瘤农杆菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：李兴林，肖天剑，韩杨，曹爱佳，高洁，张黎明，赵俊，满淑丽，高文远，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：