本发明专利技术公开了一株犬瘟热病毒敏感细胞系及其建立方法和应用,属于生物技术领域。本发明专利技术采用慢病毒四质粒包装系统,获得了一株表达犬源SLAM的稳定细胞系MDCK-CSL,其菌种保藏编号为:CGMCC?No.5881。通过比较CDV标准株在MDCK-CSL和MDCK细胞上的繁殖情况,表明CDV-Snyder?Hill标准毒株感染MDCK-CSL细胞系24小时即可观察到细胞相互融合、圆缩、明显死亡等细胞病变;而感染MDCK细胞持续6天仅表现为细胞生长缓慢,未出现细胞病变。本发明专利技术建立的CDV敏感细胞系MDCK-CSL,为CDV野毒株的分离及其完整的生物学特性研究提供了技术平台,也为犬瘟热病的防控奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于病毒培养的敏感细胞系,特别涉及一种用于犬瘟热病毒培养的敏感细胞系,本专利技术还涉及该细胞系的建立方法及应用,属于生物
技术介绍
犬痕热(Caninedistemper,CD)是由犬痕热病毒(Canine distemper virus, CDV)感染犬所引起的急性、高度接触性传染病。自1809年首次报道以来,该病已呈世界性分布,给养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业造成巨大危害。CDV属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)麻疫病毒属(Morbillivirus)。尽管 CDV 分为亚洲 I 型(Asia- I )、亚洲II型(Asia- II)、欧洲型(Europe)、美国II型(USA- II )、北极型(Arctic)和疫苗型(Vaccine)6个不同基因亚型,但公认只有一个血清型。⑶V不易在环境中存活,现地分离病 毒成功率低,限制了对CDV的研究。目前分离⑶V多采用犬肾细胞系(MDCK)、非洲绿猴肾细胞系(Vero)及绒猴B淋巴细胞系(B95a)。使用MDCK分离CDV野毒株时病毒所形成的细胞病变不明显且形成时间较长,而VeiO会导致CDV毒力下降。虽然B95a分离CDV的成功率较高,但利用其所分离到的病毒株除能与犬源SLAM(SALM,⑶V的已知受体)发生作用外,也能利用人源及绒猴源SLAM,人为的扩大⑶V的宿主范围,给生物安全带来了严重隐患。因此建立能用于⑶V分离与繁殖的敏感细胞系,在CDV的研究中具有重要意义。在转染遗传物质到细胞基因组中的工作中,重组慢病毒载体是一个强大和有效地工具。慢病毒能作用于细胞周期的G0/G1期,同时具有嗜核性,所以可以感染分裂期细胞和非分裂期细胞,感染包括所有的哺乳动物细胞(神经元细胞、干细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞等)、干细胞和原代培养的细胞。慢病毒载体还具有转移基因片段容量大(9kb)、目的基因可整合至靶基因细胞组长期表达、免疫反应小等优点,所以获得了较广的应用范围。慢病毒载体也是RNAi表达的主要手段,同化学合成和酶切形成的SiRNA相比具有几个优点其一,可以携带GFP或荧光素酶等报告基因共表达,便于跟踪、选择和富集转染的细胞;其二,可以根据需要表达不同类型的小RNA分子(siRNA、shRNA或miRNA);其三,具有较高的转染效率,使基因沉默维持较长时间。本专利技术立足于CDV野毒株的分离及检测,采用慢病毒四质粒包装系统建立了用于分离CDV病毒株的敏感细胞系MDCK-CSL,为CDV野毒株的分离及其完整的生物学特性研究提供了技术平台,也为CDV感染进行早期诊断,防止CD感染蔓延,及制定CD防控策略提供了依据。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一株能够用于分离犬瘟热病毒株的敏感细胞系;本专利技术的目的之二在于提供所述敏感细胞系在培养或分离犬瘟热病毒株中的应用。本专利技术的目的是通过以下技术手段实现的本研究采用慢病毒四质粒包装系统,将犬源SLAM目的基因重组于转移载体pCDH-CMV-MCS-EFl-GFP-T2A-Puro后,利用包装质粒pMDlg-pRRE,包膜蛋白表达质粒PMD2G,辅助基因质粒pRsv-REV,四质粒共同转染于293T细胞进行慢病毒的包装,经纯化浓缩后获得的病毒滴度为5. 4X 108TU/ml。将包装后的慢病毒感染MDCK细胞,利用标志基因表达的绿色荧光蛋白(EGFP)及嘌呤霉素抗性,通过有限稀释法获得了一株表达犬源SLAM的犬瘟热病毒敏感细胞系。本专利技术的一株犬瘟热病毒敏感细胞系,命名为MDCK-CSL,建议的分类命名为采用慢病毒重组构建的表达SLAM的MDCK细胞,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址在北京市朝阳区北辰西路I号院3号中科院微生物研究所,其菌种保藏编号为=CGMCC No. 5881,保藏日期为2012年3月6日。 利用间接免疫荧光及激光共聚焦技术对MDCK-CSL细胞系外源基因SLAM进行了定性及定位检测,在非嘌呤霉素压力维持下,该犬源SLAM外源基因至30代仍能在MDCK-CSL细胞膜上稳定表达。通过比较CDV标准株(Snyder Hi 11毒株)在MDCK-CSL和MDCK细胞上的繁殖情况,表明Snyder Hill标准毒株感染MDCK-CSL细胞系24h即可观察到细胞相互融合、圆缩、明显死亡等细胞病变;而感染MDCK细胞持续6d仅表现为细胞生长缓慢,未出现细胞病变。因此,本专利技术又提出了所述的犬瘟热病毒敏感细胞系在培养或分离犬瘟热病毒中的应用。其中,所述的犬瘟热病毒可以为犬瘟热病毒野毒株。利用现有的RT-PCR方法,对Snyder Hill毒株在MDCK-CSL细胞进行连续传代CDV核酸检测验证,结果证实在MDCK-CSL细胞连续传代后第5代仍可检测到病毒核酸。利用免疫印迹法(Western blotting)对Snyder Hill毒株在MDCK细胞及MDCK-CSL细胞进行连续传代进行抗原检测,在MDCK-CSL细胞连续传至第5代后仍可检测到目的条带,证明该犬源SLAM在MDCK-CSL细胞中具有良好地生物学活性。对送检⑶V疑似临床病料,在RT-PCR诊断为阳性的基础上,利用本专利技术所建立的表达犬源SLAM的稳定细胞系,接种MDCK-CSL细胞系后24h即可观察到细胞相互融合、圆缩、明显死亡等特征性细胞病变;对送检CDV疑似临床病料进行连续传代,RT-PCR方法仍可检测到该病毒存在。本专利技术的一种用于分离犬瘟热病毒野毒株的方法,其特征在于包括以下步骤(I)疑似犬瘟热病病料的采集及处理采集疑似犬瘟热病毒感染的动物粪便及血液,将其混合物经磷酸缓冲液重悬混匀后,4°C离心,取上清经滤膜除菌后分装于-70°C备用;(2)病毒在MDCK-CSL的增值将本专利技术所述的犬瘟热病毒敏感细胞系MDCK-CSL培养至细胞生长至80%单层后,弃去培养基,经磷酸缓冲液清洗2遍后,将步骤(I)处理过的病料上清接种于MDCK-CSL细胞感作2h后,弃去上清后换维持液培养至80%病变后收获病毒; (3)病毒RNA的提取及cDNA合成病变的MDCK-CSL细胞反复冻融3次后经提取病毒RNA,进行cDNA合成;(4)⑶V疑似病料的RT-PCR鉴定及H基因的扩增、克隆利用现有的RT-PCR方法鉴定该疑似病料,并利用合成的用于扩增⑶V H基因的引物进行PCR扩增,产物克隆于pMD18-T中,进行酶切鉴定。其中,优选的,所述的用于扩增⑶V的RT-PCR鉴定引物为NI 上游 5,-GATCATAGACGACCCTGATG-3’NI 下游 5,-GACCCTTCGTCTACAATTTTG-3,扩增片段144bp,95°C预变性 5min,94°C变性 30s,55. 5°C退火 30s,72°C延伸 45s,30个循环,72°C延伸lOmin,PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。其中,优选的,所述的用于扩增⑶V H基因的引物为 上游5,-GGGGTACCGCCACCATGCTCTCTTACCAAGACAAG-3’下游5 ’ -AAGCGGCCGCTACCATCAAGGTTTTGAAC-3,。本研究立足于⑶V野毒株的分离及检测,建立⑶V敏感细胞系MDCK-CSL,为⑶V野毒株的分离及其完整本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株犬瘟热病毒敏感细胞系,命名为MDCK?CSL,其特征在于所述的细胞系保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其菌种保藏编号为:CGMCC?No.5881,保藏日期为2012年3月6日。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员:姜骞,曲连东,林欢,刘加森,郭冬春,司昌德,
申请(专利权)人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,
类型:发明
国别省市:
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