在韩国分离的犬瘟热病毒和使用该病毒的重组疫苗制造技术

公开了一种在韩国发现的新型韩国犬瘟热病毒和使用该病毒的用于犬瘟热的重组疫苗。

【技术实现步骤摘要】
和现有技术本专利技术涉及在韩国发现的新型韩国犬瘟热病毒和使用该病毒的用于犬瘟热的重组疫苗。犬瘟热是在犬类中具有非常高传染性的、具有代表性的急性发热疾病，其不分地区和季节而出现。该疾病是引起高死亡率的病毒性疾病，其在幼犬(puppy)中发展成急性或亚急性状态，并通过胃肠系统、呼吸系统、上皮系统或中枢神经系统而出现，从而导致被感染的免疫力低下的幼犬或老犬死亡。犬瘟热的特征性临床症状是全身粘膜中的急性炎症和非化脓性脑炎，这些病症在免疫力低下的犬中形成，例如小于1岁(尤其是3-6个月)的幼犬或老犬。犬瘟热是由于属于副粘病毒(Paramyxovirus)科的犬瘟热病毒(下文中简称为“CDV”)经口或呼吸道的感染而出现的。从病毒进入犬身体之时开始直至临床病征出现具有3-6天(平均4天)的潜伏期，单独的病毒感染形成弱的临床症状。可是，在CDV感染之后，这些症状常常由于继发性细菌感染而加重，这些继发性细菌感染包括支气管败血性包特氏菌(Bordetella bronchiseptica)或酿脓链球菌(Streptococcus hemolyticus)引起的呼吸系统感染和沙门氏菌(Salmonella)或大肠杆菌(E.coli)引起的胃肠感染。CDV最通常是通过来自感染了CDV的犬的小滴分泌物直接传播的，也是由于通过被从鼻或眼排出物和尿液中分泌出的CDV污染的饲养环境的间接感染而传播的。通过小滴分泌物的CDV传播感染上呼吸系统，进入血液流，并最后感染全身的免疫系统或器官。大多数感染了CDV的个体变得具有低下的免疫力，因此易患继发性细菌感染，并在最坏的情况下死亡。已经作了许多努力来预防具有高传染性的犬瘟热，并因此获得了来自兽医临床领域的世界性关注。最初的尝试在20世纪60年代之后在美国、欧洲国家和别处进行，以开发使用病毒的灭活疫苗，该病毒在源自仓鼠肺细胞的培养细胞中繁殖。近来，在包括韩国在内的许多国家中已经使用组织培养开发出减毒活疫苗，因此实现了对于犬瘟热的有效预防。可是，许多近期的研究报道了在20世纪90年代之后，在最邻近的国家日本中，来自显示出犬瘟热临床病征的犬中的CDV分离株之中存在新的突变体，其具有不同于世界性普遍存在的CDV株系的分子生物学特性。CDV是有包膜的RNA病毒，它们在外包膜上表达两类对于其致病性和免疫原性起作用的蛋白质。特别地，已经在参与最初的病毒侵入宿主细胞过程的“血凝素(H)蛋白”中发现了最高的抗原变异，该蛋白质广泛用作检测该病毒的基因改变的主要标记。因此，在全世界的国家中，当通过逆转录聚合酶链反应(下文中简称为“RT-PCR”)扩增编码在每个国家中传播的CDV的H蛋白的血凝素(H)基因，并通过限制性片段长度多态性(下文中简称为“RFLP”)测定法(在其中用限制性内切酶消化RT-PCR产物并在琼脂糖凝胶上进行分离以比较CDV分离株的H基因之间的RFLP图式)来进行分析时，发现了许多不同于目前的CDV疫苗的野生CDV株系。近来，在日本进行的H基因氨基酸序列的系统发生分析揭示出，至少两种CDV H基因基因型在包括日本在内的亚洲地区的犬类中传播；一种是以前在日本传播的几乎所有日本CDV分离株均属于其的基因型，另一种以前在日本没有描述。这两种CDV H基因基因型包含这样的H基因，即其具有不同于目前可获得的疫苗株系和在美国、欧洲国家和别处流行的CDV株系的其他谱系或基因型的氨基酸序列。在韩国，尽管犬类已经用在美国或欧洲国家生产的CDV疫苗进行了免疫接种，它们还是会逐渐增多地再次感染CDV。基于这一现象，认为经遗传修饰的CDV特别在韩国是存在的。可是，没有准确的证据表明存在韩国CDV。在这一点上，本专利技术人想要找到还未报道过的新型韩国CDV株系。技术问题因此，本专利技术旨在提供在韩国引起犬瘟热的新型韩国CDV，和使用该病毒的用于犬瘟热的重组疫苗。附图简述附图说明图1显示了用于确定本专利技术的病毒是否为CDV(犬瘟热病毒)的电泳分析结果。图2显示了用于确定本专利技术的病毒是否为属于亚洲/H2基因型的CDV的RFLP分析结果。图3显示了本专利技术的韩国CDV的H基因核苷酸序列在系统树中的位置。本专利技术的构建本专利技术的病毒是引起犬瘟热的CDV，其特征在于其是特别在韩国发现的新型韩国CDV株系。如上所述，基于编码CDV的H蛋白的H基因之间的系统发生差异，已经发现了多种变异。一个近来的日本报道描述了对于在亚洲发现的CDV的系统发生分组(M.Hashimoto等人，Archives of Virology，2001，146149-155)。在该报道中，RFLP分析揭示出，将具有与常规CDV疫苗Onderstepoort的H基因不同的RFLP图式的KDK-1株系分类为亚洲/H1基因型。此外，从来自感染了CDV的个体的直肠和口部拭子试样获得的98-002等H基因显示出与亚洲/H1基因型不同的RFLP分布图，其中将拭子试样中的CDV分离株分类为亚洲/H2基因型。可是，分类为亚洲/H2基因型的98-002等不是指分离的病毒，而是指从感染了CDV的个体的直肠和口部拭子试样取得的H基因本身。也就是说，上面的报道表明了存在亚洲/H2基因型的CDV的可能性，但是这样的病毒实际上还没有分离得到(M.Mochizuki等人，Journal ofClinical Microbiology，1999，372936-2942)。图2显示了本专利技术病毒(泳道4-9)、Onderstepoort(泳道1)、KDK-1(泳道2)和98-002(泳道3)的每个H基因中的一部分的RFLP分析结果，其中H基因在相同条件下用RT-PCR进行扩增。发现本专利技术的病毒具有与分类为亚洲/H1基因型的常规CDV疫苗Onderstepoort和KDK-1株系不同的H基因基因型，但是该H基因基因型与分类为亚洲/H2基因型的98-002类似。此外，如图3中所示，发现本专利技术的CDV株系为属于新基因型的病毒，该新基因型在系统发生上不同于常规的CDV疫苗株系或目前在日本已知的CDV株系。98-002是从犬的直肠和口部拭子试样取得的H基因，其可以作为确定一种CDV是否具有亚洲/H2基因型的标准，但是不能直接影响个体病毒的分离和鉴定，因为其不是病毒。基于这一发现，将根据本专利技术分离和鉴定的且含有SEQ ID NO.1所示H基因的病毒命名为“汉城98病毒”，其保藏于在2003年2月25日加入韩国培养物收集联盟的韩国微生物保藏中心(KCCM)，并具有编号KCCM 10467。另外，本专利技术提供了用于犬瘟热的重组疫苗，其使用本专利技术的犬瘟热病毒的整体或一部分，并含有药物可接受的添加剂。药物可接受的添加剂可选自本领域熟练技术人员在本领域中通常使用的添加剂。用于犬瘟热的重组疫苗可以使用本专利技术的犬瘟热病毒通过任何本领域中已知的方法进行制备。优选地，重组疫苗用犬瘟热病毒的SEQ IDNO.1所示H基因的整体或一部分进行制备。通过下面的实施例可以更好地理解本专利技术，列出这些实施例是为了举例说明本专利技术，而不能将其解释为对本专利技术的限制。实施例1犬瘟热病毒的分离(步骤1)试样制备于1998年9月，通过在韩国汉城的一所动物医院递交1个月大的北京哈叭狗幼犬的尸体和血液试样，该幼犬的CDV免疫史未知，但诊断为患有犬瘟热。(步骤2)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种亚洲／Ｈ２基因型的犬瘟热病毒，其用于制备用于犬瘟热的疫苗，并具有编号ＫＣＣＭ１０４６７。

【技术特征摘要】
KR 2004-3-11 10-2004-00165971.一种亚洲/H2基因型的犬瘟热病毒，其用于制备用于犬瘟热的疫苗，并具有编...

【专利技术属性】
技术研发人员：李重馥，张炯宽，杨龙镇，文省哲，全溶秀，金永仁，
申请(专利权)人：科米药物国际株式会社，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]