一种构建犬瘟热病毒反向遗传系统的方法技术方案

本发明专利技术的目的是提供一种构建犬瘟热病毒反向遗传系统的方法，本发明专利技术中引物设计充分考虑到在构建质粒FA、FB和FC时要保证各段基因开放阅读框的完整性，尤其是质粒FB含有完整H基因和F基因，H和F基因是CDV主演的研究内容，对毒力和免疫原性有重要影响，质粒FB的构建为本发明专利技术在以后使用中对CDV主要研究内容的基因操作提供了便利，此外个各引物和酶切位点的选择也是基于这方面的考虑，可以将各主要基因片段完整酶切替换等基因克隆操作。总之，本方法中通过间质粒FA、FB和FC的构建相比有方法大量减少了基因克隆的次数，位后期不同目的用途提供了便利条件。

【技术实现步骤摘要】
一种构建犬瘍热病毒反向遗传系统的方法
本专利技术属于病源微生物基因组学研究
，具体涉及。
技术介绍
犬痕热是由犬痕热病毒(Canine Distemper Virus,CDV)感染引起的,具有高度接触性、致死性的急性败血症。CDV在副粘病毒家族中与麻疹病毒、牛瘟病毒同属麻疹病毒属，是副粘病毒科中一个血清学上密切相关的属，宿主特异性却各自不相同。犬瘟热病毒感染犬可导致隐性感染，有肠道症状，或有呼吸道症状，有时伴有中枢神经系统症状。神经症状也可能是犬瘟热感染的晚期表现。犬瘟热病毒基因组是不分节段RNA病毒全长15690bp，在自然界分离的病毒基因长度上存在高度一致性，并遵循六碱基原则。其3’ -端和5’ -端分别是先导序列和尾随序列，它们在调苄基因复制和转录中起作用，5’-端的非编码区可能含有核衣壳化起始位点和编码反基因3’ -端 复制启动子。犬瘟热病毒自3’ -端至5’ -端非重叠方式表达6个结构蛋白分别为核衣壳蛋白(Nucleocapsidprotein, NP)、磷蛋白(Phosphoprotein, PP)、基质蛋白(Matrix protein, MP)、融合蛋白(Fusion protein, FP)、血凝素蛋白(Haemagglutininprotein, HP)和大蛋白(RNA-dependent RNA-polymerase protein, LP)反向遗传学技术已广泛应用于病毒学研究的各个领域，极大地推动了病毒学基础与应用研究的快速发展。病毒反向遗传操作系统借助真核质粒使载体上的病毒cNDA在细胞内产生有活性的DNA/RNA片段，通常DNA和一部分RNA具有感染性可以产生病毒，另外一些RNA病毒需要病毒蛋白结合产生病毒。在早期的CDV拯救系统使用能够产生RNA聚合酶的拯救细胞或表达RNA聚合酶痘病毒感染，载体含有T7RNA聚合酶启动子来产生病毒RNA。随着技术发展和研究深入，犬瘟热病毒广泛采用的拯救系统主要使用真核表达载体，两端分别加丁型肝炎核酶(Hdv Rz)和锤头核酶(Ham Rz)的全基因，再构建表达N、P和L蛋白的辅助质粒，共转染细胞以后产生核糖核蛋白复合物(RNP)进入细胞复制周期，产生CDV。这一方法首先在狂犬病毒上应用，这是首个应用此方法的负链RNA病毒，随后广泛用于其它负链RNA病毒，如正粘病毒、副粘病毒等。但副粘病毒科基因长度较长，通常在15k左右，所以随后的CDV拯救都是分6-10段扩增病毒基因片段逐段连接。例如GASSEN(Establishment of a Rescue System forCanine Distemper Virus)在2000文章中方法为例,作者选择12个酶切位点分11个片段扩增⑶V基因包含两段核酶序列连接如T载体，然后逐段酶切连接入pEMC或pBS SK II载体，该方法构建感染性克隆需要进行11次亚克隆以获得完整基因。，极易在构建的过程中发生错误，且耗时长导致效率低下。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，本专利技术的方法可以快速的构建CDV感染性克隆，方便后期操作，从而弥补现有技术的不足。本专利技术首先提供一种构建CDV反向遗传全基因载体的方法，包括如下的步骤:I)首先设计用于扩增CDV基因组不同片段的9对引物，引物的序列信息如下:本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种构建CDV反向遗传全基因载体的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：1)首先设计用于扩增CDV基因组不同片段的9对引物，引物的序列信息如下：引物名称引物序列序列表顺序F1f5’‑ACCAGACAAAGTTGGCTAT‑3’SEQ ID NO:1F1r5’‑AGTAAGCATCCTCATCTTGG‑3’SEQ ID NO:2F2f5’‑ATGAGGATGCTTACTAAGATGC‑3’SEQ ID NO:3F2r5’‑TGGATCTATTACTCTGACTTGG‑3’SEQ ID NO:4F3f5’‑AGAGTAATAGATCCAGGACTCG‑3’SEQ ID NO:5F3r5’‑AGGCACCACAGGACTAAC‑3’SEQ ID NO:6F4f5’‑CGAGCTCCGCTTCTAGGAATCTCACTT‑3’SEQ ID NO:7F4r5’‑ATCATATCACCTCCAGAGTATC‑3’SEQ ID NO:8F5f5’‑AGTCCTGTGGTGCCTCGGAAT‑3’SEQ ID NO:9F5r5’‑GGTAGCGGTCAGCATATTGATTATCT‑3’SEQ ID NO:10F6f5’‑ATGCTGACCGCTACCTCAGAC‑3’SEQ ID NO:11F6r5’‑GCCATAGCAGTATCAGTCATTAGCC‑3’SEQ ID NO:12F7f5’‑TAACATCGCCAACTCTACAACCA‑3’SEQ ID NO:13F7R5’‑CCAAGCTTCACTGTCTAGGCTAAGAGGCATAA‑3’SEQ ID NO:14F8f5’‑TGATACTGCTATGGCAATTG‑3’SEQ ID NO:15F8r5’‑TCATCCGTAATTCCTCAAGT‑3’SEQ ID NO:16F9f5’‑GAGGAATTACGGATGATTACCC‑3’SEQ ID NO:17F9r5’‑ACCAGACAAAGCTGGGTATGA‑3’SEQ ID NO:18以提取的病毒核酸反转录产物为模板，使用引物F1f和F1r扩增得到片段F1；引物F2f和F2r扩增得到片段F2；引物F3f和F3r扩增得到片段F3；引物F4f和F4r扩增得到片段F4；引物F5f和F5r扩增得到片段F5；引物F6f和F6r扩增得到片段F6；引物F7f和F7r扩增得到片段F7；引物F8f和F8r扩增得到片段F8；引物F9f和F9r扩增得到片段F9；所有产物连接T载体得到F1～F9质粒；2)使用Ham Rz p1为上游引物和F1r为下游引物，以F1质粒为模板，扩增得到Ham Rz+F1片段，将Ham Rz+F1片段连接到T载体得到质粒Ham Rz+F1；使用上游引物F9f，HDV Rz p1和HDV Rz p2为下游引物，以F9质粒为模板，通过前后两轮PCR得到F9+HDV Rz片段，连接到T载体得到质粒F9+HDV Rz；3)用引物Infusion_P1和F1r，以质粒Ham Rz+F1为模板；用引物F2f和F2r，质粒F2为模板；用引物F3f和Infusion_P2，质粒F3为模板进行扩增；三个产物依次连接入T载体为FA质粒；引物Infusion_P3和F4r以质粒F4为模板的PCR产物；引物F5f和Infusion_P4以质粒F5为模板的PCR产物，二个产物接入T载体为FB(‑)质粒，然后将质粒FB(‑)和质粒F4经过Sac I和Hpa I双酶切后连接为质粒FB(+)；质粒FB(+)和质粒F7经过Nco I和Hind III双酶切连接成为片段质粒FB；引物Infusion_P5和F8r以质粒F8为模板的PCR产物；引物F9f和Infusion_P6以质粒F9+HDV Rz为模板的PCR产物连接入T载体为FC质粒；引物名称引物序列序列表顺序Infusion_P15’‑GGATCCTCTAGAGATATCGCGGCCGCTTGTCTGGTCTG‑3’SEQ ID NO:22Infusion_P25’‑CTGCAGGTCGACGATATCAGGCACCACAGGACTAAC‑3’SEQ ID NO:23Infusion_P35’‑GGATCCTCTAGAGATATCAGTCCTGTGGTGCCTCGGAAT‑3’SEQ ID NO:24Infusion_P45’‑CTGCAGGTCGACGATATCGCCATAGCAGTATCAGTCATTAGCC‑3’SEQ ID NO:25Infusion_P55’‑GGATCCTCTAGAGATATCTGATACTGCTATGGCAATTG‑3’SEQ ID NO:26Infusion_P65’‑CTGCAGGTCGACGATATCGGGCCCCGCCCTCCCT‑3’SEQ ID NO:2...

【技术特征摘要】
1.一种构建CDV反向遗传全基因载体的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤: I)首先设计用于扩增CDV基因组不同片段的9对引物，引物的序列信息如下: 2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的HamRz pUHdv Rz pUHdv Rz p2的引物序列信息如下: ...

【专利技术属性】
技术研发人员：单虎，蒋文明，杜翔，黄娟，杨瑞梅，张传美，秦志华，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37