本发明专利技术公开了一种胃癌多药耐药细胞系。该胃癌多药耐药细胞系是采用基因克隆构建人胃癌多药耐药细胞系，其构建方法是利用逆转录病毒作为载体，将mdr1cDNA基因克隆到胃癌细胞，使其表达有功能的mdr1，产生稳定的耐药性，从而建立胃癌mdr细胞系。该方法建立的人胃癌多药耐药细胞系，提高了胃癌细胞对化疗药物的耐药性，同时构建了单一mdr1介导胃癌多药耐药的研究平台，在研究胃癌mdr1介导多药耐药及其逆转的作用机理以及深入研究胃癌多药耐药提供细胞模型等方面具有应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属肿瘤生物学领域，具体涉及一种人胃癌多药耐药细胞系。
技术介绍
胃癌在我国是死亡率位居前列的恶性肿瘤之一，化疗是胃癌的主要疗法之一，特别对于术后残留癌细胞的清除、防止癌症复发，化疗具有重要的治疗价值。但是，临床上对应用的化疗药物及给药方案的总体评价并不理想，甚至有文献报道胃癌的术后化疗既不能降低复发率，也不能改善预后。研究表明，胃癌化疗失败主要与癌细胞对化疗药物产生多药耐药(multi-drug resistance,MDR)有关,多药耐药成为化疗效果的阻碍。因此，胃癌多药耐药的机制、临床意义及耐药逆转成为肿瘤研究中的热点之一，建立实验需要的胃癌耐药细胞模型更具有重要的意义。·肿瘤细胞的MDR是指肿瘤细胞对某一化疗药物产生耐药后，对其他化学结构及机理不同的化疗药物也产生交叉耐药性。胃癌MDR指癌细胞在接触一种抗恶性肿瘤药后，同时对多种结构不同、作用机制各异的的药物产生了耐受性。国内曾用于MDR研究的胃癌耐药细胞系，多是在体外用抗癌药物逐渐诱导的方法建立的MDR细胞。该类方法建立的细胞系能很好地模拟人类肿瘤化疗过程中经常发生的MDR现象。但此方法建立的MDR细胞，有生物特性和敏感性差异，当处于无化疗药物培养时，稳定性较差，耐药性容易丢失。另外，由该方法建立的细胞产生的MDR机制复杂，如SGC7901/VCR细胞MDR的产生，除P糖蛋白(P_gp)外，还有多药耐药相关蛋白基因MRP等参与，这不利于对MDR现象中单一机制及其逆转的研究，如逆转胃癌细胞mdrl介导MDR的中药活性成分筛选等。
技术实现思路
mdrl是人类多药耐药基因的基因家族中唯一有功能的耐药基因，编码产物为P糖蛋白(P-gp)。人类的mdrl基因位于7q21. 1，mdrl基因组序列包括28个内含子和26个分割读码框序列，由 Homo sapiens BAC clone CTB-60P12 和 CTB-137N13 from 7, completesequence提供，内含子长度不等,变化在126 15203 bp之间。基于表达载体对插入片段大小的限制，mdrl基因序列太大无法实现表达载体的构建,mdrl cDNA序列长度可以实现。pHaMDRl是缺陷病毒载体，需经包装细胞系提供结构蛋白，才具有感染性，是在敲除癌基因的鼠哈维氏肉瘤病毒的基础上构建而成的。pHaMDRl载体插入mdrl cDNA序列，导入细胞后表达全长的mdrl mRNA。本专利技术将转录病毒载体pHaMDRl转染包装细胞293T，以产生具有感染性的病毒液。本专利技术目的是公开一种胃癌多药耐药细胞系，该胃癌多药耐药细胞系可按以下步骤建立(I)将SGC7901细胞放于含100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的RPMI-1640培养基中，置37 °C、5%C02、饱和湿度的细胞培养箱中培养；(2)将逆转录病毒载体pHaMDRl转化至DH5 a大肠杆菌，扩增并提取pHaMDRl，对提取的pHaMDRl进行酶切；(3)用lipofectamine 2000转染试剂将酶切后的逆转录病毒载体pHaMDRl转染包装细胞293T，转染后的包装细胞293T继续培养，收集病毒；(4)将病毒液加入步骤(I)所得的SGC7901细胞，37 °C培养6 h后，换用含血清的培养基继续培养；(5)重复上述步骤(4)，将感染后的细胞培养于含60ng / ml秋水仙碱的培养基，培养至克隆形成为止，即得到具有耐药性的SGC7901/mdrl 细胞系。其中，步骤(3)中所收集病毒的病毒滴度为2. 7X IO5 CFU/ml。其中，步骤(5)中每天重复上述步骤(4)，共重复三次。本专利技术的胃癌多药耐药细胞系是采用基因克隆构建人胃癌多药耐药细胞系，其构建方法是利用逆转录病毒作为载体，将mdrl cDNA基因克隆到胃癌细胞，使其表达有功能的mdrl，产生稳定的耐药性，从而建立胃癌mdr细胞系，以克服上述缺点。·本专利技术所述的胃癌多药耐药细胞系，可应用于胃癌mdr细胞模型的研究，筛选化疗药物及判断化疗药物的敏感性，分析肿瘤化疗多药耐药机制。利用本专利技术方法建立的胃癌耐药细胞系，经过细胞克隆检测，并利用SPSS17. 0统计软件进行分析，结果显示，克隆细胞系mdrl mRNA的表达水平、P-gp的表达水平升高，细胞内ADR蓄积量及细胞对ADR的敏感性减少，均区别于亲本细胞SGC7901，接近于SGC7901/VCR。该结果表明，转入的mdr I基因在克隆细胞系中得到了高表达，细胞内的P_gp及mdrl mRNA的表达量显著增加，细胞对化疗药物的耐药性有了较大提高，从而证明mdrl基因编码的P-gp是细胞产生耐药性的机制之一。本专利技术的优点是①提高了胃癌细胞对化疗药物的耐药性。转入的mdrl基因在感染细胞克隆组得到了高表达，细胞内的P-gp及mdrl mRNA的表达量显著增加，细胞对化疗药物的耐药性有了较大提高，从而证明mdrl基因编码的P-gp是细胞产生耐药性的机制之一；②构建了单一 mdrl介导胃癌MDR的研究平台，为研究胃癌mdrl介导MDR及其逆转打下基础；③利用生物转基因方法建立的胃癌MDR细胞，将为深入研究胃癌MDR提供理想的细胞模型。附图说明图I pHaMDRl质粒图谱。图2秋水仙碱筛选两周的感染组细胞生长情况(100X)，感染细胞突起明显，呈贴壁状。图3感染细胞克隆的外源基因整合检测结果。I为SGC7901 / VCR组；2为SGC7901组；3为感染细胞克隆组；4为阳性对照；M为DNA Marker。图4各组细胞的P-gp表达(400X)。P-gp免疫组化阳性颗粒位于细胞膜，呈棕黄色。①SGC7901/VCR组；②SGC7901 ;③感染细胞克隆组。图5流式细胞仪检测感染后细胞内ADR蓄积量的变动。左侧图为未加ADR组，右侧图为加入ADR组；A为SGC7901/VCR组，B为SGC7901组，C为感染细胞克隆组。实施例实施例I细胞培养 将SGC7901细胞放于含100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的RPMI-1640培养基中，置37 °C、5%C02、饱和湿度的细胞培养箱中培养。0. 2%胰蛋白酶消化传代。实施例2 pHaMDRl质粒的转化和扩增 将pHaMDRl加入大肠杆菌DH5 a感受态细胞，冰上作用30 min, 42 °C水浴90 S，冰上作用2 min ;加入400 的LB培养基，37 °C摇床200 r/min 45 min ;随后接种到含100U g/ml Amp的LB冷平板上，将平板倒置入37 °C恒温培养箱培养过夜；用接种环分别挑取已转化质粒pHaMDRl的DH5 a大肠杆菌，37 1摇菌过夜； 实施例3质粒pHaMDRl的包装及病毒滴度测定· 将2 ill lipofectamine 2000转染试剂，加入到含50 U I无血清、无抗生素的培养基的200 u I管中混匀，室温孵育5 min ;将稀释的质粒加入稀释的Lipofectamine 2000中混匀，室温放置20 min，使DNA- Lipofectamine 2000复合物形成；取对数生长的293T细胞，用无抗生素的培养基稀释，以2X IO5个/孔接种于24孔细胞培养板中；培养24 h后，用无本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种胃癌多药耐药细胞系，其特征在于胃癌多药耐药细胞系按以下步骤建立：（1）将SGC7901细胞放于含100？U/ml青霉素和100？U/ml链霉素的RPMI？1640培养基中，置37？℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养；（2）将逆转录病毒载体pHaMDR1转化至DH5α大肠杆菌并扩增；（3）用lipofectamineTM？2000转染试剂将逆转录病毒载体pHaMDR1转染包装细胞293T，转染后的包装细胞293T继续培养，收集病毒；（4）将病毒液加入步骤（1）所得的SGC7901细胞，37？℃培养6？h后，换用含血清的培养基继续培养；（5）重复上述步骤（4），将感染后的细胞培养于含60ng∕ml秋水仙碱的培养基，培养至克隆形成为止，即得到具有耐药性的SGC7901/mdr1细胞系。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：高福莲，李红军，李勇莉，路军秀，包巍，王国栋，程珊，侯锐，李晋雪，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：
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