【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞基因工程，具体涉及pi3k基因敲除的肺泡上皮细胞的应用、细胞模型、构建方法。
技术介绍
1、瓦斯爆炸为我国煤矿事故灾害之首，瓦斯爆炸所致损伤中，肺损伤的发生率最高。瓦斯爆炸肺冲击伤一开始可能没有明显的症状和体征，但是随着时间的推移会逐渐出现明显的临床表现，首先出现的可能是呼吸功能障碍，接着会伴随一系列的呼吸系统症状，严重时甚至发展为急性呼吸窘迫综合征。瓦斯爆炸肺冲击伤时，肺部影像学上也会有明显的变化，例如肺纹理增多、双肺透光度降低，出现云絮状阴影。但是瓦斯爆炸肺冲击伤患者的临床表现一般比影像学显示的更重一些，例如低血压、心动过缓和呼吸暂停是瓦斯爆炸肺冲击伤中经典的三联征，而且患者的肺部感染率高，死亡率高，严重威胁着相关职业人员的生命健康。肺泡上皮细胞损伤是导致肺水肿和炎症反应的主要原因，在瓦斯爆炸肺损伤进程中发挥着重要作用。肺泡上皮细胞损伤是导致肺水肿和炎症反应的主要原因，在瓦斯爆炸肺损伤进程中发挥着重要作用，主要表现为肺水肿和肺出血。因此如何有效清除肺内液体，缓解肺水肿对瓦斯爆炸肺的治疗具有重要意义。
2、上皮细胞钠离子通道(epithelial sodium channels,enac)是广泛分布于全身各上皮细胞膜表面的离子通道，在呼吸道主要分布于肺泡上皮细胞和气管上皮细胞中，具有调节细胞内na+浓度，维持机体液体平衡的功能。enac的表达过低，会造成肺泡腔内液体无法及时排除，造成肺水肿，在肾脏中白藜芦醇可以提高enac的表达。肺水肿的调节通路是否与enac的表达直接相关，白藜芦醇是否也同样可以
技术实现思路
1、为了克服现有技术的缺陷，本专利技术的目的之一在于提供pi3k基因敲除的肺泡上皮细胞在构建瓦斯爆炸肺损伤细胞模型方面的应用。
2、本专利技术的目的之二在于提供一种瓦斯爆炸肺损伤细胞模型，采用本专利技术提供的pi3k基因敲除的肺泡上皮细胞构建而成。
3、同时，本专利技术还在于提供一种pi3k基因敲除的肺泡上皮细胞的构建方法。
4、为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：
5、pi3k基因敲除的肺泡上皮细胞的应用，应用于构建瓦斯爆炸肺损伤细胞模型。
6、一种瓦斯爆炸肺损伤细胞模型，包括pi3k基因敲除的肺泡上皮细胞构建而成的模型组；肺泡上皮细胞构建成的对照组。
7、上述瓦斯爆炸肺损伤细胞模型，还包括采用冲击波理疗仪对pi3k基因敲除的肺泡上皮细胞进行体外刺激，造模后培养，作为模型组；
8、采用冲击波理疗仪对肺泡上皮细胞进行体外刺激，造模后培养，作为对照组；
9、所述肺泡上皮细胞为a549。
10、本专利技术创造性采用pi3k基因敲除的肺泡上皮细胞作为模型组，以肺泡上皮细胞为对照组，分别采用冲击波理疗仪按照专利cn115322986b记载的方法构建肺损伤细胞模型，通过分别对模型组和对照组设计对比试验，对比是否进行白藜芦醇干预后，敲除pi3k基因是否抑制pi3k/akt通路抑制enac的表达，验证白藜芦醇是否可以通过激活pi3k/akt调控enac的表达，为瓦斯爆炸肺水肿治疗的靶点选择提供理论支撑。
11、pi3k基因敲除的肺泡上皮细胞的构建方法，包括构建靶向敲除pi3k-p85亚基的第15外显子的cas9/sgrna真核表达载体，将cas9/sgrna真核表达载体转染至肺泡上皮细胞构建获得pi3k基因敲除的肺泡上皮细胞。
12、上述构建方法还包括构建靶向敲除pi3k-p85亚基的第15外显子的cas9/sgrna真核表达载体的具体方法包括分别构建靶向第一靶点pi3k-p85亚基第14内含子的pi3k-1.crispr/cas9真核表达载体，和靶向第二靶点pi3k-p85亚基第15内含子序列的pi3k-2.crispr/cas9真核表达载体。
13、进一步的，所述pi3k-1.crispr/cas9真核表达载体的靶位点序列为agatacatacactacagagcagg，如seq id no:1所示；pi3k-2.crispr/cas9真核表达载体的靶位点序列为tatgcctagggaagacagcaagg，如seq id no:2所示。
14、进一步的，pi3k-1.crispr/cas9真核表达载体靶向靶位点的sgrna由上游引物pi3k-gf1和下游引物pi3k-gr1拟合而成；其中pi3k-gf1核苷酸序列为caccgagatacatacactacagagc，如seq id no:3所示；pi3k-gr1核苷酸序列为aaacgctctgtagtgtatgtatctc，如seq id no:4所示。
15、进一步的，pi3k-2.crispr/cas9真核表达载体靶向靶位点的sgrna由上游引物pi3k-gf2和下游引物pi3k-gr2拟合而成；其中pi3k-gf2核苷酸序列为caccgtatgcctagggaagacagca，如seq id no:5所示；pi3k-gr2核苷酸序列为aaactgctgtcttccctaggcatac，如seq id no:6所示。
16、本专利技术基于crispr/cas9基因编辑技术，创造性的选择pi3k-p85亚基的第15外显子作为敲除区域，实现pi3k的高效敲除；具体的选择pi3k-p85亚基第14内含子和pi3k-p85亚基第15内含子双靶点敲除，设计sgrna，实现目标基因高效敲除。
17、进一步的，为了提高打靶效率，将两个靶点插入到报告载体构建双报告载体，报告载体为以含有第二靶点的tar引物为拟合引物构建的pi3k.ssa-rpg；tar引物的序列为pi3k-tf：
18、ggccgcctcgagagatacatacactacagagcaggtatgcctagggaagacag caagg tgag，如seq id no:7所示
19、和pi3k-tr：
20、gatcctcaccttgctgtcttccctaggcatacctgctctgtagtgtatgtatctc tcgaggc，如seqid no:8所示。
21、进一步的，还包括将pi3k-1.crispr/cas9：pi3k-1.crispr/cas9：pi3k.ssa-rpg按照1：1：2的质量比转染至肺上皮细胞a549，并培养，构成获得所述pi3k基因敲除的肺泡上皮细胞。
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1.PI3K基因敲除的肺泡上皮细胞的应用，其特征在于，应用于构建瓦斯爆炸肺损伤细胞模型。
2.一种瓦斯爆炸肺损伤细胞模型，其特征在于，包括PI3K基因敲除的肺泡上皮细胞构建而成的模型组；肺泡上皮细胞构建成的对照组。
3.如权利要求2所述的瓦斯爆炸肺损伤细胞模型，其特征在于，还包括采用冲击波理疗仪对PI3K基因敲除的肺泡上皮细胞进行体外刺激，造模后培养，作为模型组；
4.PI3K基因敲除的肺泡上皮细胞的构建方法，其特征在于，包括构建靶向敲除PI3K-p85亚基的第15外显子的Cas9/sgRNA真核表达载体，将Cas9/sgRNA真核表达载体转染至肺上皮细胞构建获得PI3K基因敲除的肺泡上皮细胞。
5.如权利要求4所述的PI3K基因敲除的肺泡上皮细胞的构建方法，其特征在于，构建靶向敲除PI3K-p85亚基的第15外显子的Cas9/sgRNA真核表达载体的具体方法包括分别构建靶向第一靶点PI3K-p85亚基第14内含子的PI3K-1.CRISPR/Cas9真核表达载体，和靶向第二靶点PI3K-p85亚基第15内含子序列的PI3K-2.C
6.如权利要求5所述的PI3K基因敲除的肺泡上皮细胞的构建方法，其特征在于，所述PI3K-1.CRISPR/Cas9真核表达载体的靶位点序列为AGATACATACACTACAGAGCAGG，如SEQ IDNO:1所示；PI3K-2.CRISPR/Cas9真核表达载体的靶位点序列为TATGCCTAGGGAAGACAGCAAGG，如SEQ ID NO:2所示。
7.如权利要求6所述的PI3K基因敲除的肺泡上皮细胞的构建方法，其特征在于，PI3K-1.CRISPR/Cas9真核表达载体靶向靶位点的sgRNA由上游引物PI3K-GF1和下游引物PI3K-GR1拟合而成；其中PI3K-GF1核苷酸序列为CACCG AGATACATACACTACAGAGC，如SEQ ID NO:3所示；PI3K-GR1核苷酸序列为AAAC GCTCTGTAGTGTATGTATCTC，如SEQ ID NO:4所示。
8.如权利要求7所述的PI3K基因敲除的肺泡上皮细胞的构建方法，其特征在于，PI3K-2.CRISPR/Cas9真核表达载体靶向靶位点的sgRNA由上游引物PI3K-GF2和下游引物PI3K-GR2拟合而成；其中PI3K-GF2核苷酸序列为CACCG TATGCCTAGGGAAGACAGCA，如SEQ ID NO:5所示；PI3K-GR2核苷酸序列为AAAC TGCTGTCTTCCCTAGGCATAC，如SEQ ID NO:6所示。
9.如权利要求5～8任一项所述的PI3K基因敲除的肺泡上皮细胞的构建方法，其特征在于，还包括构建报告载体，报告载体为以含有两个靶点的TAR引物为拟合引物构建的PI3K.SSA-RPG；TAR引物的序列为PI3K-TF：
10.如权利要求9所述的PI3K基因敲除的肺泡上皮细胞的构建方法，其特征在于，还包括将PI3K-1.CRISPR/Cas9：PI3K-1.CRISPR/Cas9：PI3K.SSA-RPG按照1：1：2的质量比转染至肺上皮细胞A549，并培养，构成获得所述PI3K基因敲除的肺泡上皮细胞。
...【技术特征摘要】
1.pi3k基因敲除的肺泡上皮细胞的应用，其特征在于，应用于构建瓦斯爆炸肺损伤细胞模型。
2.一种瓦斯爆炸肺损伤细胞模型，其特征在于，包括pi3k基因敲除的肺泡上皮细胞构建而成的模型组；肺泡上皮细胞构建成的对照组。
3.如权利要求2所述的瓦斯爆炸肺损伤细胞模型，其特征在于，还包括采用冲击波理疗仪对pi3k基因敲除的肺泡上皮细胞进行体外刺激，造模后培养，作为模型组；
4.pi3k基因敲除的肺泡上皮细胞的构建方法，其特征在于，包括构建靶向敲除pi3k-p85亚基的第15外显子的cas9/sgrna真核表达载体，将cas9/sgrna真核表达载体转染至肺上皮细胞构建获得pi3k基因敲除的肺泡上皮细胞。
5.如权利要求4所述的pi3k基因敲除的肺泡上皮细胞的构建方法，其特征在于，构建靶向敲除pi3k-p85亚基的第15外显子的cas9/sgrna真核表达载体的具体方法包括分别构建靶向第一靶点pi3k-p85亚基第14内含子的pi3k-1.crispr/cas9真核表达载体，和靶向第二靶点pi3k-p85亚基第15内含子序列的pi3k-2.crispr/cas9真核表达载体。
6.如权利要求5所述的pi3k基因敲除的肺泡上皮细胞的构建方法，其特征在于，所述pi3k-1.crispr/cas9真核表达载体的靶位点序列为agatacatacactacagagcagg，如seq idno:1所示；pi3k-2.crispr/cas9真核表达载体的靶位点序列为tatgcctagggaagacagcaagg，如seq id no:2所示。
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【专利技术属性】
技术研发人员：任文杰，白义春，姚三巧，马畅，安珍，田林强，赵英政，李海斌，董新文，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：
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