一种人肺腺癌细胞系及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种人肺腺癌细胞系及其应用。该人肺腺癌细胞，于2014年5月23日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072，培养物名称为人肺腺癌细胞ZRLC-1，保藏编号为CCTCC NO：C2014103。该人肺腺癌细胞ZRLC-1作为实验材料在肺腺癌基础和临床研究中的应用，可用于建立肺癌发生、发展或转移的动物模型。本发明专利技术的人肺腺癌细胞系性状稳定，可稳定多次传代，并且高表达EpCAM，E-cadherin等上皮标志，细胞流式显示EpCAM阳性细胞达99.70%，为肺癌研究提供新的更接近于临床肿瘤生物学特性的实验材料。

【技术实现步骤摘要】
一种人肺腺癌细胞系及其应用
本专利技术属于微生物动物细胞系领域，特别涉及一种人肺腺癌细胞系及其应用。
技术介绍
原发性肺癌是目前最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年新发肺癌大约130万人，占全部新发癌症病例总数的12.3﹪，居首位，而尤以我国是该疾病的高发国家。近年的流行病学调查数据显示，肺癌是我国人群中发病率和死亡率上升最快的癌症之一。卫生部公布的的全国第三次死因调查结果中，肺癌居我国癌症死因首位，占全部癌症死因的22.7﹪，与70年代相比，我国的肺癌死亡率上升4.65倍，特别值得关注。目前手术、化疗、放疗这些传统方案仍然是治疗肺癌的有效途径，随着相关辅助学科的发展，靶向治疗、生物治疗为肺癌患者带来新的希望，但是多数肺癌患者确诊时已是晚期，无手术机会，能手术的患者术后转移率高，术后生存率不高，总体预后欠佳。因而，寻求更加有效的肺癌治疗手段显得尤为重要。肺癌细胞株作为肺癌发生机理及抗肺癌药物开发的接近临床肿瘤生物学特性的实验材料已被广泛应用，但全世界目前报道的肺癌细胞株仍为数不多。同时，已有的肺癌细胞株在反复的传代过程中，细胞特性与原始肿瘤细胞相比发生了很大变化。因此，肺癌原代细胞培养并建立细胞系在现阶段具有很大的应用价值，而针对我国肺癌的高发现象，建立我国自己的肺腺癌细胞模型具有更显著的科学意义和社会意义。运用临床肿瘤组织直接体外培养建立细胞系往往混杂其它非肿瘤细胞，成功率较低。本专利技术通过运用临床肿瘤标本先初步体外扩增到一定的细胞数，再经动物皮下接种富集纯化肿瘤细胞，进而通过原代培养建立人源性肿瘤细胞系。该方法成功率较高，且细胞系接近于肿瘤的临床生物学特性，对药物的耐药性及敏感性有很好的预测性，是研究肺癌发生分子机制和抗肿瘤药物筛选的理想实验材料。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有的人肺腺癌细胞系存在的生物多样性低，与临床上肺腺癌的生物学性状相差较大等不足，提供一种新的人肺腺癌细胞系。本专利技术的人肺腺癌细胞，于2014年5月23日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(地址：中国.武汉.武汉大学即湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心，邮编：430072)，培养物名称为人肺腺癌细胞ZRLC-1，保藏编号为CCTCCNO：C2014103。本专利技术采用取自一位55岁女性肺腺癌手术切除标本，经体外初步培养扩增成一定数量级的细胞悬液后，接种于裸鼠皮下，成瘤后取出肿瘤组织，经体外培养获得稳定传代的一种新的肺腺癌细胞，命名为：ZRLC-1。本专利技术人肺腺癌细胞ZRLC-1具有以下生物学特性：1.细胞系贴壁生长，无接触抑制；2.细胞系生长快速和代谢旺盛，具有良好的体外培养扩增性；3.细胞系染色体核型分析提示该细胞为近二倍体细胞系，有较多的染色体缺失、异位及衍生现象；4.细胞系高表达EpCAM（上皮细胞粘附分子），E-cadherin（E-钙粘蛋白）等上皮表面标志，细胞流式显示EpCAM阳性细胞达99.7﹪；5.细胞系在无血清培养基条件下，具有一定的克隆球形成能力；6.细胞传至第五代按2*10^6、2*10^5、2*10^4、2*10^3数量级接种裸鼠，均可成瘤，致瘤性强，组织切片提示移植瘤组织学特性与原发瘤相似。本专利技术的进一步目的是提供该人肺腺癌细胞ZRLC-1作为实验材料在肺腺癌基础和临床研究中的应用，可用于建立肺癌发生、发展或转移的动物模型，可用于制备人肺腺癌相关药物疗效的分子检测方法中的应用。本专利技术的人肺腺癌细胞系性状稳定，可稳定多次传代，并且高表达EpCAM，E-cadherin等上皮标志，细胞流式显示EpCAM阳性细胞达99.70﹪，为肺癌研究提供新的更接近于临床肿瘤生物学特性的实验材料。具有强致瘤性，可以成功制备肺癌发生、发展或转移的动物模型，所制得的动物模型可以用于研究肺癌发生发展分子机制、筛选抗肺癌小分子化合物、探究肺癌的耐药机理以及发现肺癌转移新标志等，是人肺癌基础研究和临床前期应用的理想细胞系。附图说明图1.本专利技术人肺腺癌细胞ZRLC-1的光镜下(×100)形态学观察；图2.本专利技术人肺腺癌细胞ZRLC-1的生长时间曲线；图3.本专利技术人肺腺癌细胞ZRLC-1的染色体分析结果；图4.本专利技术人肺腺癌细胞ZRLC-1的表面标志蛋白质印迹检测结果；图5.本专利技术人肺腺癌细胞ZRLC-1的表面标志EpCAM的流式检测结果；图6.本专利技术人肺腺癌细胞ZRLC-1无血清培养基条件下细胞克隆球形成结果，其中A为第3天的克隆球图，B为第7天的克隆球图；图7.本专利技术人肺腺癌细胞ZRLC-1的成瘤性；图8.肿瘤的病理组织切片；其中A.临床上取得的肿瘤标本；B.第1代裸鼠移植瘤；C.第2代裸鼠移植瘤。具体实施方式下面结合附图及具体实施例对本专利技术做进一步的分析（下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法）。本专利技术的人肺腺癌细胞，于2014年5月23日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072)，培养物名称为人肺腺癌细胞ZRLC-1，保藏编号为CCTCCNO：C2014103。实施例1.细胞的制备裸鼠：5只裸小鼠，雄性，体重16.0±1.0g，鼠龄4周，饲养于SPF动物房。裸鼠由浙江省实验动物中心统一饲养。从浙江大学医学院附属第二医院获得新鲜的临床肺腺癌切除标本(女，55岁，原发性肺腺癌，病理诊断结果为：腺癌)，立即浸入预冷的无菌Hanks缓冲液(含500U/ml青霉素G、500U/ml庆大霉素)中。在生物安全柜中，用无菌Hanks缓冲液冲洗标本4～5次，用眼科剪剪碎成1mm3小块，置于1mg/mlI型胶原酶/透明质酸酶中37℃消化1小时，中间每隔15分钟剧烈震荡1次，300目筛网过滤，接种到DMEM培养基（含10ng/ml重组人表皮生长因子，10μg/ml重组人胰岛素，10﹪胎牛血清蛋白，100U/ml青霉素G，100U/ml庆大霉素）中，培养48h后，将细胞转至普通RPMI1640培养基(含10﹪胎牛血清蛋白，100U/ml青霉素G、100U/ml庆大霉素)中，扩增细胞至约10^7数量级进行裸鼠皮下接种。动物接种后，健康状态良好，行为正常。接种一周后，通过触摸发现在接种部位皮下有肿瘤小结节，小结节于接种二周后开始生长明显，至接种后30天时，肿瘤体积超过200mm3。原代培养：体外接种扩增的人肺腺癌单细胞悬液30～40天后，将荷瘤裸鼠用过量二氧化碳气体麻醉处死，无菌解剖，取出肿瘤组织，进行原代培养，方法如下：用Hanks缓冲液(含500U/ml青霉素G、500U/ml庆大霉素)漂洗肿瘤组织块4～5次，去除结缔组织和坏死组织；用无菌手术刀片将肿瘤组织剪切成约1mm3小块；置于1mg/mlI型胶原酶/透明质酸酶中37℃消化1小时，中间每隔15分钟剧烈震荡1次，300目筛网过滤，接种到DMEM培养基中（含10ng/ml重组人表皮生长因子，10μg/ml重组人胰岛素，10﹪胎牛血清蛋白，100U/ml青霉素G、100U/ml庆大霉素）中。传代培养：当细胞布满培养瓶底部后，进行细胞传代，具体步骤如下：吸弃旧培养液，加入5mlPBS缓冲液润洗两遍，吸弃废液，加入1ml新鲜的0.25﹪胰蛋白酶溶液，于37℃孵箱中孵育，观察到细胞质回缩、细胞间隙增大，待细胞脱落后，加入3ml新鲜的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人肺腺癌细胞系，其特征在于其于2014年5月23日保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，培养物名称为人肺腺癌细胞ZRLC‑1，保藏编号为CCTCC NO：C2014103。

【技术特征摘要】
1.一种人肺腺癌细胞系，其特征在于其于2014年5月23日保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，培养物名称为人肺腺癌细胞ZRLC-1，保藏编号为CCTCCNO：C2014103。2.如权利要求1所述的一种人肺腺癌细胞系，其特征在于人肺腺癌细胞ZRLC-1作为建立肺癌发生、发展或转移的动物模型中的应用。3.如权利要求1或2所述的一种人肺腺癌细胞系，其特征在于具有以下生物学特性：细胞系贴壁生长，无...

【专利技术属性】
技术研发人员：王凯，徐霞，柴守杰，朱永良，王晓健，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33