高转移倾向的人乳腺癌细胞系及其建立方法技术

本发明专利技术涉及癌细胞系，特别是一种高转移倾向的人乳腺癌细胞系及其建立的方法，属动物细胞系领域。有关肿瘤的侵袭与转移的机制目前尚不十分清楚。需要建立肿瘤转移动物模型对其进行深入的研究。以往在肿瘤转移动物模型中应用裸鼠，在本发明专利技术中，我们采用ＳＣＩＤ小鼠作为实验对象，取乳腺癌亲本ＭＣＦ－７细胞悬液（５×１０＃＋［７］／０．２ｍ１）皮下接种于ＳＣＩＤ小鼠肩部，接种ＭＣＦ－７细胞６８天后，将ＳＣＩＤ鼠处死，取出肺脏，进行原代培养，当由组织块中长出的细胞能够长满培养瓶底部后，进行细胞传代，将该细胞命名为ＬＭ－ＭＣＦ－７。当ＬＭ－ＭＣＦ－７细胞体外培养２０代后，将瘤细胞再回注到ＳＣＩＤ鼠皮下，方法同前；成瘤率达到１００％（５／５只），并且在ＳＣＩＤ鼠的肺脏、肾脏、脾脏、骨髓、淋巴结和心脏等脏器出现广泛转移。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及癌细胞系，特别是一种高转移倾向的人乳腺癌细胞系及其建立的方法，属动物细胞系领域。以往在肿瘤转移动物模型中应用裸鼠，该品系的特点是先天性无胸腺，T细胞功能明显丧失，B细胞功能正常，NK细胞活力增强，完全无毛。被广泛应用于人类肿瘤转移因素、肿瘤异植性和肿瘤诊断治疗等肿瘤研究领域。有研究应用人肿瘤块接种动物来模拟肿瘤转移的自然过程，但是成功率较低。将培养的肿瘤细胞接种SCID鼠具有很好的应用价值，具有重复性好、转移效率高和时间短等优点。因此，在本研究中我们应用SCID鼠肿瘤转移动物模型，成功的建立了高转移倾向人乳腺癌细胞系LM-MCF-7。本专利技术的技术方案是利用SCID鼠人乳腺癌的转移病灶肺组织作为建系瘤源，作为一种新的筛选高转移倾向肿瘤细胞的方法，采用体外原代培养方式，建成了一株具有高转移倾向的人乳腺癌细胞系，命名为LM-MCF-7。本项目为国家自然科学基金资助项目(30270322)的阶段性成果。本专利技术的有益效果是1、SCID小鼠动物模型可以用来筛选高转移倾向肿瘤细胞株； 2、获得的高转移倾向细胞株可用于筛选抗肿瘤转移的药物；3、通过与亲本细胞的比较，可应用高转移倾向细胞株用于筛选肿瘤转移相关基因；4、可用于研究肿瘤转移的发病机理；5、进而制备肿瘤转移的DNA疫苗；6、通过接种动物来检测抗肿瘤转移的疫苗的效果。图2.第70代贴壁生长的LM-MCF-7细胞(A，×100)，细胞均呈簇样生长，细胞为典型的上皮样细胞，其形状不规则，细胞排列紧密，界限清楚，接触性抑制丧失。对照为亲本细胞MCF-7(B，×100)。图3.LM-MCF-7细胞SCID鼠骨髓转移灶(HE×400，箭头示)。细胞接种30天以后，骨髓自发转移率100％(20/20)，提示该细胞可能以血道转移为主。符合临床乳腺癌转移特征。图4.LM-MCF-7细胞系染色体。结果显示该细胞染色体核型变异大，为多倍体细胞，染色体发生数目和结构的畸变，染色体分布范围在59-65条。染色体数目改变主要表现为染色体单体、三体和多体。符合恶性肿瘤的遗传学特征。图5.亲本细胞MCF-7接种SCID鼠后68天，肺组织病理组织观察，在肺组织中有早期转移生长的肿瘤组织(箭头示)。(从该组织中原代培养获得LM-MCF-7细胞)。2)确认转移部位将SCID鼠处死，对各个组织的病理切片进行显微镜下观察，确立其转移灶的部位为肺脏、脾脏、骨髓和淋巴结等。3)高转移倾向的人乳腺癌细胞系的获得接种MCF-7细胞68天后，将SCID鼠处死，取出肺脏，进行原代培养。采用下列步骤双抗的Hank’s液漂洗组织块5分钟；使用剪刀剪碎组织，去除血液、脂肪、神经组织、结缔组织和坏死组织；将肺组织剪切成1mm3左右小块；将剪切好的小块用眼科镊送入培养瓶，用接种针将其均匀摆置，间隔0.5cm；组织块放好后，轻轻将培养瓶翻转，让瓶底朝上，盖好瓶盖，放置在37℃CO2培养箱内；放置3小时，将培养瓶慢慢翻转平放，向瓶内注入10ml RPMI1640培养液(含20％血清)，静置培养；原代培养每3天换液一次，去除已漂浮的组织块和残留的血细胞。当由组织块中长出的细胞能够长满培养瓶底部后，进行细胞传代，具体步骤如下向瓶中加入1-2ml消化液(胰酶和EDTA)，室温3分钟后，观察到细胞质回缩、细胞间隙增大，吸除消化液，加入PBS将培养瓶残留的消化液洗掉；用吸管吸去瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，使之脱离瓶壁形成细胞悬液，计数，分别接种新的培养瓶。当细胞传代到第三代，将原代培养时用的20％胎牛血清降为10％，细胞仍然生长良好，形态变得更加均一。在本实验中，发现来源于肺组织的原代培养传代的细胞呈现上皮样，细胞形态均一，无接触抑制，并且生长十分迅速，大约两天能够长满瓶底，需要进行传代。该细胞系在本实验室已进行了100代以上的培养。将该细胞命名为LM-MCF-7。4)LM-MCF-7细胞体内成瘤实验当LM-MCF-7细胞体外培养20代后，将瘤细胞再回注到SCID鼠皮下，方法同前。结果显示，成瘤率达到100％，并且在SCID鼠的肺脏、肾脏、脾脏、骨髓、淋巴结和心脏等脏器出现广泛转移。本专利技术——LM-MCF-7细胞的检测鉴定结果本专利技术采用含有小牛血清的RPMI1640培养液培养LM-MCF-7细胞，使其能体外长期生长和稳定传代。经实验观察与验证，体外生长的LM-MCF-7具有典型的上皮样形态，接触生长抑制丧失。遗传学研究证实该细胞为异倍体，染色体数目和结构畸变严重，符合恶性肿瘤的遗传学特征。该细胞SCID鼠接种成瘤率为100％，并在肺、肾、脾和心脏等脏器发生广泛转移。经检测，LM-MCF-7细胞系仍保留瘤组织原有的生物学特性，它的建立可为乳腺癌转移机制的基础研究和临床的干预研究提供理性的模型。a.LM-MCF-7细胞表型的鉴定呈现上皮样，细胞形态均一，无接触抑制。b.形态学观察亲本细胞MCF-7接种SCID鼠后，与来源于亲本细胞MCF-7的高转移倾向细胞LM-MCF-7接种SCID鼠后的成瘤组织相比，在结构上二者相似，符合乳腺癌的病理学特征。c.染色体的鉴定制备染色体，观察结果显示染色体为人染色体，呈多倍体。d.细胞来源的鉴定应用乳腺癌相关抗原(CA15-3 Breast Antigen)的抗体进行免疫组化染色，呈阳性反应。表明为人乳腺癌细胞。e.细胞周期的鉴定应用流式细胞仪获得细胞周期倍增时间。权利要求1.一种高转移倾向人乳腺癌细胞系(LM-MCF-7)，具有生物学、遗传学和病理学特征，还具备特殊转移表型。2.根据权利要求1所述的高转移倾向人乳腺癌细胞系(LM-MCF-7)，其生物学特征是1)能在体外长期生长和稳定传代2)典型的上皮样形态，接触性生长抑制丧失3)可无限继代培养3.根据权利要求1所述的高转移倾向人乳腺癌细胞系(LM-MCF-7)，其遗传学特征是1)染色体结构畸变，分布范围在50～70条2)细胞为异(多)倍体(单体、三体和多体)4.根据权利要求1所述的高转移倾向人乳腺癌细胞系(LM-MCF-7)，其病理学特征是SCID小鼠体内转移部位肿瘤细胞与皮下肿瘤的细胞结构相似。5.根据权利要求1所述的高转移倾向人乳腺癌细胞系(LM-MCF-7)，其特殊转移表型病理学特征是SCID小鼠接种成瘤率和皮下接种的转移率为100％，接种部位和方式无限制。6.一种高转移倾向人乳腺癌细胞系(LM-MCF-7)的建立方法，其特征在于通过下述方法(实验)建立1)接种SCID鼠取乳腺癌亲本MCF-7细胞悬液(5×107/0.2ml)皮下接种于SCID小鼠肩部，SCID小鼠由中国医学科学院天津血液学研究所提供；2)确认转移部位将SCID鼠处死，对各个组织的病理切片进行显微镜下观察，确立其转移灶的部位为肺脏、脾脏、骨髓和淋巴结等；3)高转移倾向的人乳腺癌细胞系的获得接种MCF-7细胞68天后，将SCID鼠处死，取出肺脏，进行原代培养，采用下列步骤用加有双抗的Hank’s液漂洗组织块5分钟；使用剪刀剪碎组织，去除血液、脂肪、神经组织、结缔组织和坏死组织；将肺组织剪切成1mm3左右小块；将剪切好的小块用眼科镊送入培养瓶，用接种针将其均匀摆置，间隔0.5cm；组织块放好后，轻轻将培养瓶翻转，让瓶底朝上，盖好瓶盖，放置在37℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高转移倾向人乳腺癌细胞系（ＬＭ－ＭＣＦ－７），具有生物学、遗传学和病理学特征，还具备特殊转移表型。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：叶丽虹，张晓东，朱惠芳，吴莲英，鞠永健，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]