一种肺高转移性人乳腺癌细胞系制造技术

本发明专利技术属微生物动物细胞系领域，具体涉及一种具有自发性肺高转移潜能的人乳腺癌细胞系ＭＤＡ－ＭＢ－２３１／０８－００１Ｈ及其建立方法。本细胞系为人源性细胞，与其亲本细胞有９２个差异表达基因；体外细胞生长、增殖能力和侵袭能力高于其亲本细胞；成瘤性和肺转移率超过亲本细胞，接种４周后ｓｃｉｄ小鼠原位瘤体积为４２２４．６７±１０３８．９５ｍｍ３，重量为２．０９±０．５１ｇ，自发性肺转移率为１００％，转移灶中位数为４１个／肺。本发明专利技术细胞系及由此建立的动物模型能模拟从肿瘤细胞在植入位点的生长到在靶器官形成转移灶的全过程，与临床实际情况十分吻合，可以方便地用于乳腺癌肺转移机理及相关药物的研究。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属微生物动物细胞系领域，具体涉及一种具有自发性肺高转移潜能的人乳腺癌细胞系及其建立方法。
技术介绍
据报道，乳腺癌已经成为严重危害妇女健康的首要恶性肿瘤。2008年癌症统计报 告指出，美国妇女如果活到85岁的话，则一生中将有1/8的人(约12. 7% )患乳腺癌。在所 有女性肿瘤中乳腺癌高居榜首，占到26%，远远超过了第2位的肺癌和第3位的结直肠癌， 更令其他癌症望尘莫及。近年来，随着经济的发展和人们生活方式的改变，我国的乳腺癌发 病率也呈明显上升趋势，已在大城市女性各种恶性肿瘤中居于首位。以上海为例，自1989 年起乳腺癌已经成为女性第一位的恶性肿瘤，1991年乳腺癌的粗发病率为36. 6/10万， 1997年为46. 0/10万，2000年为56. 2/10万，2004年上升为74. 2/10万，年均递增3. 96% 。 临床研究显示，远处转移一直是乳腺癌患者治疗失败和死亡的主要原因。尸检资料显示，死 于乳腺癌的患者中，60% 80%伴有肺转移。因此，加强对乳腺癌细胞转移机制的研究很有 必要，而建立可靠的肺高转移细胞系和动物模型则是当务之急。 现有技术公开了在人乳腺癌细胞系中，可用于小鼠移植瘤模型转移研究的细胞系 有MDA-MB-435、 MDA-MB-231 、 MCF-7、 MAII禾P BCML-TA299等。其中MDA-MB-435在裸鼠乳腺 脂肪垫(mfp)原位接种后4、8和12周时肺转移率分别为30%、70%和100%，其中，亚克隆 细胞MDA-MB-435HM在4周时肺转移率达100% 。 MDA-MB-435作为肺高转移性乳腺癌细胞 系的典型代表曾被长期广泛使用。但近年来关于MDA-MB-435的细胞起源争议颇大，有研究 指出该细胞系可能来自于黑色素瘤而非乳腺癌(Nat Genet，2000) ;MDA_MB_231也是一种 常用的人乳腺癌细胞系，具有成瘤率高(100% )、潜伏期短(15天)等优点，但其自发性肺 转移率不高，一般不超过10%。显而易见，直接用MDA-MB-231进行肺转移相关研究并非所 宜。所幸已有人从MDA-MB-231中分离出一种高转移性亚克隆MDA-MB-231LM2 (4175)，只用 相当少的该细胞(2X103)尾静脉注射即可使小鼠发生肺转移，左心室注射可成功建立骨转 移模型。在13只mfp原位接种该细胞(1 X 106)的BALB/c裸鼠中到38天时计有7只检出 了肺部转移灶，肺转移率为53.8% (Nature, 2005)。鉴于经尾静脉一次性大量注射癌细胞 造成的肺转移在很大程度上偏离临床实际情况，而原位接种该细胞时的自发性肺转移率仍 然较低(约50% )且实验周期较长(历时超过5周)，因此认为从MDA-MB-231中分离出自 发性肺转移率更高的亚克隆细胞系既是必要的，也是可能的。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种肺高转移性人乳腺癌细胞系一MDA-MB-231/08-001H。本专利技术的肺高转移性人乳腺癌细胞系能用于乳腺癌肺转移机理及相关药物的研究。 本专利技术采用美国典型培养物保藏中心(ATCC)的人乳腺癌细胞系MDA-MB-231 (ATCC编号HTB-26，由一位51岁高加索女性乳腺癌患者的胸腔积液中分离而得)为亲本细胞，通过组合利用scid和BALB/c皿/皿小鼠、尾静脉注射和乳腺脂肪垫 (mfp)交叉接种、原位移植瘤卸载促转移灶形成、体内连续筛选、体外扩增和传代等策略，分 离得到了具有自发性肺高转移潜能的人乳腺癌细胞系MDA-MB-231/08-001H，已于2008年8 月25日保藏，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，北京市 朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101，保藏编号CGMCC No. 2635，分类命名人 乳腺癌细胞系。 本细胞系具有以下生物学特性经微卫星DNA检领U，结果显示 MDA-MB-231/08-001H与其亲本细胞MDA-MB-231均为人源性细胞，但两者之间至少有92 个差异表达基因；在体外的细胞生长、增殖能力和侵袭能力均高于其亲本细胞；在scid 小鼠和BALB/c裸小鼠移植瘤模型其成瘤性和肺转移率均显著性地超过亲本细胞。接种 MDA-MB-231/08-001H细胞4周后在scid小鼠其原位瘤体积为4224. 67 ±1038. 95mm3，重量 为2. 09±0. 51g(n = 6)，自发性肺转移率为100%，转移灶中位数为41个/肺。与此相对， 接种MDA-MB-231细胞后原位瘤体积为749. 63±282. 35mm3，重量为0. 37±0. 13g(n = 6)， 自发性肺转移率为0% 。在BALB/c裸小鼠也得到了类似的结果。 本专利技术的细胞系具有以下特点 1)遗传背景清楚，生物学特性稳定。该细胞系来自于广泛使用的人乳腺癌细胞系 MDA-MB-231，经鉴定属于人源性细胞，其生长、侵袭能力、成瘤性等基本生物学特性与亲本 细胞一致，经多次传代及修饰后仍保持稳定。 2)应用面宽，适宜于在多种免疫缺陷动物建立人乳腺癌移植瘤模型。该细胞系既 可在T、 B细胞双重缺陷的scid小鼠建立移植瘤模型，也可在只有T细胞缺陷的BALB/c裸 小鼠成功地建立移植瘤模型。 3)建立模型的方法接近于临床实际情况，自发性肺转移率高，实验周期短。该细胞系采用乳腺脂肪垫(mfp)接种，无论在scid小鼠还是在BALB/c裸小鼠均可稳定可靠地建立起移植瘤模型，4周时的肺转移率可达100%，转移灶密集且常有融合趋势。 本专利技术细胞系及由此建立的动物模型能模拟从肿瘤细胞在植入位点的生长到在靶器官形成转移灶的全过程，与临床实际情况十分吻合，可以方便地用于乳腺癌肺转移机理及相关药物的研究。附图说明 图1是人乳腺癌MDA-MB-231/08-001H细胞系在scid小鼠的移植瘤。 图2人乳腺癌MDA-MB-231/08-001H细胞系在scid小鼠和BALB/c裸鼠的肺转移，其中的箭头所指是转移灶。具体实施例方式实施例1肺高转移细胞的筛选和建系 本专利技术所涉及的细胞均培养于含10%胎牛血清(FCS)的Leibovitz's L_15细胞 培养基中。培养温度为37t:，气体环境为5% 0)2/95%空气，湿度为饱和湿度。传代时，用 0.25%的胰蛋白酶消化细胞，按1 : 3的比例传代。 1.肺高转移细胞的首轮筛选 ①将处于生长对数期的MDA-MB-231细胞用0. 25%的胰蛋白酶消化，制成单细胞 悬液； ②无菌条件下，用lml注射器将肿瘤细胞接种于6周龄BALB/c雌性裸小鼠(BALB/ c皿de mice)左侧第二乳头的脂肪垫(mfp)或直接注射入尾静脉(i.v.)，容量调整为 1 X 107细胞/0. lml/只(mfp)或2 X 106细胞/0. lml/只(i. v.); ③常规饲养4周后，断头放血，处死裸小鼠，并用75%的酒精浸泡消毒5分钟； ④无菌操作，解剖裸小鼠，完整取出双侧肺，在生理盐水中漂洗3次； ⑤在解剖显微镜下，用眼科剪剪取肺转移灶，将其剪碎后，移至6孔板中培养； ⑥待细胞贴壁后，更换新鲜细胞培养基； ⑦用半消化法和半机械法清除成纤维细胞； ⑧体外继续扩增本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肺高转移性人乳腺癌细胞系，其特征是所述的细胞系为肺高转移性人乳腺癌细胞系ＭＤＡ－ＭＢ－２３１／０８－００１Ｈ，保藏编号：ＣＧＭＣＣ　Ｎｏ．２６３５，具有以下生物学特性：为人源性细胞，与其亲本细胞有９２个差异表达基因；体外细胞生长、增殖能力和侵袭能力高于其亲本细胞；成瘤性和肺转移率超过亲本细胞，接种４周后ｓｃｉｄ小鼠原位瘤体积为４２２４．６７±１０３８．９５ｍｍ３，重量为２．０９±０．５１ｇ，自发性肺转移率较亲本细胞高，转移灶数目较亲本细胞多。

【技术特征摘要】
一种肺高转移性人乳腺癌细胞系，其特征是所述的细胞系为肺高转移性人乳腺癌细胞系MDA-MB-231/08-001H，保藏编号CGMCC No.2635，具有以下生物学特性为人源性细胞，与其亲本细胞有92个差异表达基因；体外细胞生长、增殖能力和侵袭能力高于其亲本细胞；成瘤性和肺转移率超过亲本细胞，接种4周后scid小鼠原位瘤体积为4224.67±1038.95mm3，重量为2.09±0.51g，自发性肺转移率较亲本细胞高，转移灶数目较亲本细胞多。2. 按权利要求l所述的肺高转移性人乳腺癌细胞系...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵志敏，欧周罗，侯意枫，罗建民，
申请(专利权)人：复旦大学附属肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]