本发明专利技术公开了一种miR-10b基因在胃癌中的应用。本发明专利技术发现一种促进胃癌生长的微小RNA，miR-10b，KLF4是miR-10b的直接靶基因，miR-10b在RNA和蛋白水平同时调节靶基因的表达。在不同细胞中观察到miR-10b，KLF4 mRNA的表达水平呈相反趋势后，利用荧光素酶报告基因分析，初步验证了KLF4是miR-10b的靶基因；此后通过miR-10b稳定表达株的建立，进一步发现miR-10b在RNA和蛋白水平同时调节靶基因的表达，最后在临床胃癌组织中再次证实了以上的调控方式。所公开的为在胃癌细胞系中KLF4是miR-10b的靶基因的首次报道，该发明专利技术利用miRNA为胃癌提供药物靶点方面提供了一定的应用价值。本发明专利技术可为胃癌的诊断和预后提供有利的技术支持。
【技术实现步骤摘要】
一种miR-10b基因在胃癌基因表达调控中的应用
本专利技术涉及一种miR-10b基因在癌症中的作用，具体涉及在胃癌中的应用。
技术介绍
恶性肿瘤的侵袭转移能力是肿瘤治疗的一大难点。近些年来，微小RNA(microRNA,miRNA)的出现为研究肿瘤的发生及侵袭转移机制提供了新的思路和途径，微小RNA(miRNA)是一类内源性、保守、稳定的非编码短单链RNA，在转录后水平调节靶基因表达miRNA在机体发育、细胞增殖、凋亡及肿瘤发生发展等生理和病理过程中发挥重要作用，成为当前生命科学研究的热点。miRNA(microRNA)是广泛存在于生物体内的19-25nt的非编码单链小分子RNA，其通过与靶基因mRNA的互补配对降解靶mRNA或抑制其翻译。研究表明miRNA在肿瘤发生过程中起重要作用，miRNA很有可能成为癌症治疗与诊断的新途径。miRNA与靶基因mRNA的非编码序列(3′-UTR或5′-UTR)存在着一对多的关系。在癌症病例中经常发现miRNA群表达失调的现象，而这些miRNA表达的改变与癌症发生密切相关。在体外实验中，改变一个或者多个miRNA的表达能够促进或者抑制癌细胞恶化，促进癌细胞恶化的miRNA可以认为是一类癌基因，反之，抑癌基因。miR-10b作为微小RNA家族中的一员，在肝癌、乳腺癌、胰腺癌、胶质瘤、垂体瘤、急性髓性白血病等肿瘤组织中都有异常表达，并且与肿瘤的侵袭性和远处转移有密切关系。胃癌在我国各种恶性肿瘤中居首位，胃癌发病有明显的地域性差别，在我国的西北与东部沿海地区胃癌发病率比南方地区明显为高。好发年龄在50岁以上，男女发病率之比为2：1。胃癌的预后与胃癌的病理分期、部位、组织类型、生物学行为以及治疗措施有关。据世界卫生组织估计，2008年全球范围内大约100万胃癌新发病例，占全部肿瘤发病的7.8％，仅次于肺癌、乳腺癌和结直肠癌。超过70％的胃癌病例发生在发展中国家，其中50％发生在中国。在我国，胃癌年龄标化发病率男性为41.3/10万，女性为18.5/10万，仅次于肺癌。大约90％-95％的胃癌为腺癌，起源于胃部上皮组织。已有文献报道miR-10b在多种癌中起到抑癌基因的作用。KLF4(Kriippel-likefactor4)是一种在多种人类组织中广泛表达的锌指转录因子，在许多不同的生理活动中具有重要作用，研究表明KLF4基因与多种肿瘤的发生发展有关，通过检测癌组织中KLF4蛋白的表达，探讨KLF4蛋白与胃癌临床病理间的关系。本专利技术拟在胃癌细胞中验证KLF4是否是miR-10b的靶基因，并探讨miR-10b在胃癌侵袭转移中的调控机制，为胃癌的临床治疗提供理论依据。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术中上述缺陷，提供一种miR-10b基因作为KLF4靶基因的调控者在制备下调胃癌细胞中KLF4表达水平药物中的应用。具体地，调节癌症细胞中KLF4表达水平为miRNA-10b抑制KLF4的表达，其中癌症细胞主要为胃癌细胞，并且其中所述miR-10b在RNA和蛋白水平同时调节靶基因KLF4的表达。本专利技术还提供了一种KLF4作为癌症治疗靶点在制备治疗癌症药物中的用途，其中癌症细胞主要为胃癌细胞。本专利技术还提供了以下具体方法，研究KLF4是否是miR-10b的靶基因，具体为：a)生物信息学方法对miR-10b的靶基因进行预测；b)不同胃癌细胞中miR-10b、KLF4mRNA表达水平的相关性检测；c)荧光素酶报告验证KLF4是miR-10b的靶基因；d)建立稳定表达miR-10b的细胞株，荧光定量PCR技术和westernblot技术阐明miR-10b作用于靶基因KLF4的核酸水平或蛋白水平；e)胃癌组织中验证miR-10b和KLF4的表达相关性。本专利技术培养多种胃癌细胞株，收集细胞进行总RNA抽提后，采用荧光定量PCR法检测不同细胞中miR-10b，KLF4mRNA的表达水平。发现miR-10b与KLF4mRNA表达呈相反趋势后，采用双荧光素酶检测法进一步验证KLF4是miR-10b的直接靶基因。进一步采用荧光定量PCR，WesternBlot检测上调miR-10b的表达对靶基因KLF4核酸和/或蛋白表达水平的调控方式。最后在临床胃癌组织样本中分析miR-10b和KLF4表达的相关性。胃癌细胞中miR-10b的表达水平影响细胞的增殖，迁移能力等，在胃癌的发生起重要的作用。KLF4与癌症的发生密切相关。miR-10b通过与其靶基因KLF4的mRNA的3′-UTR互补，抑制靶基因mRNA的翻译或直接降解靶mRNA。本实验通过软件预测、构建载体，然后在胃癌细胞中利用荧光素酶报告基因分析验证了KLF4是miR-10b的靶基因，并在AGS细胞中利用qRT-PCR技术，进一步验证了该发现。所公开的为在AGS细胞系中KLF4是miR-10b的靶基因的首次报道，该专利技术为利用miRNA-10b为胃癌提供药物靶点方面提供了一定的应用价值。附图说明图1.不同胃癌细胞中miR-10b表达水平的检测；图2.pCDH-RFP-miR10bsponge-EF1-GFP+puro质粒构建图谱；图3.PCR验证pCDH-RFP-miR10bsponge-EF1-GFP+puro，扩增RFP序列。1～6：挑取的克隆；7：阴性对照；图4.EcoRI/BamHI双酶切验证pCDH-RFP-miR10bsponge-EF1-GFP+puro，1：未酶切质粒对照；2：EcoRI/BamHI双酶切的质粒；图5.pCDH-CMV-miR10b-EF1-GFP+Puro质粒构建图谱；图6.PCR验证miR-10b表达载体，1～12：挑取的克隆，13：阴性对照；图7.EcoRI/BamHI双酶切验证pCDH-CMV-miR10b-EF1-GFP+Puro载体，1：未酶切质粒；2：EcoRI/BamHI酶切质粒；图8.慢病毒包装示意图；图9.过表达和抑制表达miR-10b后稳转细胞株中miR-10b的表达水平；图10.过表达miR-10b后，KLF4mRNA和蛋白表达水平的检测；图11.荧光素酶报告检测。图12.miR-10b在胃癌组织中的表达分布。图13.KLF4蛋白在胃癌组织中的定位和表达。具体实施方式下面结合实施例进一步描述本专利技术。实施例一：不同胃癌细胞中miR-10b，KLF4mRNA表达水平的检测培养多种胃癌细胞株，收集细胞进行总RNA抽提后，采用荧光定量PCR法检测不同细胞中miR-10b，KLF4mRNA的表达水平。结果可见，miR-10b与KLF4mRNA表达在不同的胃癌细胞中呈相反趋势，miR-10b在SGC-7901，MKN-45，BGC-823，AGS，MGC-803依次下降，而在SGC-7901，MKN-45，BGC-823，AGS，MGC-803中呈上升趋势，提示KLF4可能是miR-10b的靶基因(图1)。实施例二：慢病毒缺失表达载体pCDH-RFP-miR10bsponge-EF1-GFP+puro和过表达载体pCDH-CMV-miR10b-EF1-GFP+Puro的构建以及KLF4靶基因细胞学观察本实验设计miR-10b干扰载体，基于慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Pur本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种miR‑10b 基因作为KLF4靶基因的调控者在制备调节癌症细胞中 KLF4表达水平药物或试剂盒中的用途。
【技术特征摘要】
1.一种miR-10b基因作为KLF4靶基因的调控者在制备调节癌症细胞中KLF4表达水平药物或试剂盒中的用途。2.根据权利要求1中所述用途，其中调节癌症细胞中KLF4表达水平为MiRN...
【专利技术属性】
技术研发人员：姚行，马志红，戴利成，
申请(专利权)人：湖州市中心医院，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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