本发明专利技术的目的在于提供一种诱导型启动子、基于该启动子的基因诱导表达调控系统、以及基于该表达调控系统开发的改良微生物遗传操作工具。采用L-阿拉伯糖为诱导剂，阿拉伯糖是一种自然界普遍存在的碳源，对细胞生长无抑制作用。该诱导表达系统能够使基因表达水平上调最高达到800倍，且具有较好的严谨性，可以用于梭菌属或其它微生物细胞中目标基因的可控表达，以及用于现有遗传改造技术的优化及新工具的开发。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种微生物基因表达调控方法。
技术介绍
基因在转录水平上的调控是微生物主要的基因表达调控方式，也是当前微生物代谢工程的研究热点。转录调控受到多种顺式作用元件和反式作用因子的相互协调控制，其中启动子是重要的顺式作用元件，它基本决定一个基因是否表达、何时和何处表达。启动子通常位于功能基因的5’端上游，能够与RNA聚合酶以及其他蛋白辅助因子等反式元件相结合，从而控制基因转录的起始和效率。微生物的启动子可分为组成型启动子和诱导型启动子。组成型启动子能在所有细胞中，不分时间和空间地启动转录；诱导型启动子则能在某些特定的物理、化学和生物信号(诱导物)的刺激下，可以大幅度增加目的基因的转录水平。诱导型启动子具有广阔的基因工程应用前景，它可根据需要在细胞特定的生长阶段或生长环境下，快速诱导基因转录的“开”与“关”，实现对基因表达的预想调控，从而实现控制微生物生理代谢的目的。以纤维素降解梭菌的应用为例，梭菌属含有多种纤维素降解菌株，如解纤维梭菌(Cl os tridium cellulolyticum )和热纤梭菌(Cl os tridium thermocellum )等,他们能够高效降解纤维素合成乙醇，是潜在的通过整合生物加工技术实现木质纤维素高效利用的生产菌株。然而，野生型菌株尚不能满足木质纤维素转化的工业化要求，必须进行系统的代谢工程改造，这需要对目标内源或外源基因及相关代谢或调控途径功能的精确控制。采用可诱导转录系统是常用的实现基因功能可控的方法。目前已报道一些以化合物或射线为诱导剂的可诱导表达系统(Appl Environ Microb1l 2014;80:2410-6;Metab Eng 2012;14:59-67; Appl Environ Microb1l 2003;69:4985-8; Appl EnvironMicrob1l 2011;77:471-8; Gene Ther 2001;8:1197-201)。其中，诱导系统 Pcm_2tet01具有最高的诱导效率及严谨性，及在有诱导剂脱水四环素存在的条件下，基因表达水平可以上调313倍。但是，高浓度脱水四环素对细胞生长有害，因此该诱导系统不能在具有高剂量诱导剂的最优化条件下工作(Metab Eng 2012; 14:59_67)。因此，需要进一步开发诱导剂不抑制生长且更为高效和严谨的诱导表达调控系统。基于二类内含子的Targetron、Clostron基因革巴向操作方法具有操作简单、周期短、效率高、无需抗性筛选、对转化效率要求低等优点，能够弥补同源重组方法的缺点，已广泛的应用于基础研究和工程菌株的改造(Csh Perspect B1l 2011; 3.；J Microb1lMethods 2007;70:452-64)。二类内含子基因失活的原理是RNA “归巢(retrohoming)”效应，以L1.LtrB内含子为例，二类内含子的基因失活分两阶段进行:1) L1.LtrB内含子(核酶)自我切割形成“套索”结构；2)自我剪切形成“套索”结构的二类内含子与具有反转录酶活性的IEP (intron-encoded protein)蛋白结合，形成RNP复合体。RNP复合体识别特定的DNA序列，并将内含子RNA序列插入识别位点的DNA正义链。IEP部分消化反义链，并以内含子RNA为模板，剩余反义链DNA为引物，逆转录出与内含子RNA互补的cDNA序列。随后内含子RNA被胞内RNA酶消化，最后DNA正义链缺口被胞内DNA修复系统修复，完成基于二类内含子的基因失活过程。然而二类内含子基因靶向操作技术的特异性依赖于RNP复合体对特定序列的识别，而识别序列较短，通常为几个到十余个碱基，导致非特异性识别频率(即脱靶率)较高，严重影响了其在精确基因靶向操作方面的应用。缩短二类内含子元件在胞内的作用时间和强度有可能改善脱靶率高这一技术难题，然而该技术需要与严谨高效的诱导表达调控系统相结合。为了解决以上对高效严谨且诱导剂价廉对细胞无害的诱导表达调控系统的需求，本专利技术人开发了一种基于阿拉伯糖诱导的基因诱导表达调控系统，在微生物基因工程改造中具有良好的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种诱导型启动子、基于该启动子的基因诱导表达调控系统、以及基于该表达调控系统开发的改良微生物遗传操作工具及方法。采用L-阿拉伯糖为诱导剂，阿拉伯糖是一种自然界普遍存在的碳源，对细胞生长无抑制作用。该诱导表达系统能够使基因表达水平上调最高达到800倍，且具有较好的严谨性，可以用于梭菌属或其它微生物细胞中目标基因的可控表达，以及用于现有遗传改造技术的优化及新工具的开发。本专利技术涉及:(1)一种L-阿拉伯糖诱导的启动子DNA，具有序列表中SEQ ID NO:2所示的序列。(2)DNA还包括具有SEQ ID NO:2所示的序列的DNA的功能等价体，即具有SEQIDN0:2的变异序列的DNA，其仍旧能够指导连接在其下游的核酸在阿拉伯糖诱导条件下表达。变异序列包括在严格条件下能够与具有SEQ ID NO:2所示的序列DNA杂交的DNA序列。本文中使用的“严格条件”是公知的，包括诸如在含400mM NaCl、40mM PIPES(pH6.4)和ImM EDTA的杂交液中于60V杂交12-16小时，然后在65°C下用含0.1SDS、和0.1%SSC的洗涤液洗涤15-60分钟。(3)变异序列还包括与SEQ ID NO:2所示序列有至少90%、95%、96%、97%、98%、或99%序列同一性的DNA序列。其中，序列同一性的百分比可以通过公知的生物信息学算法来获得，包括 Myers 和 Miller 算法(B1informatics,4(1):11-17,1988)、Needleman-Wunsch 全局比对法(J.Mol.B1l., 48 (3):443-53,1970)、Smith-Waterman 局部比对法(J.Mol.B1l.，147:195-197，1981)、Pearson 和 Lipman 相似性搜索法(PNAS,85(8):2444-2448,1988)、Karlin 和 Altschul 的算法(Altschul 等，J.Mol.B1l.,215(3):403-410,1990 ；PNAS, 90:5873-5877,1993)。这对于本领域技术人员来说是熟悉的。(4)诱导表达系统的组成:该诱导表达系统包含诱导剂L-阿拉伯糖、反馈抑制蛋白AraR (SEQ ID NO: 1)和可与反馈抑制蛋白结合的启动子Para(SEQ ID NO: 2)。(5)诱导表达系统的构建:构建该诱导表达系统需要通过PCR扩增获得反馈抑制蛋白AraR的结构基因及其启动子区PaMR (SEQ ID NO: 3)和终止子区TaraR (SEQ ID NO: 4)，通过PCR获得具有反馈抑制蛋白结合位点的启动子Para;通过基因克隆的方法将上述元件整合到一个具有抗性基因的质粒骨架上，并在具有反馈抑制蛋白结合位点的启动子区下游设计酶切位点，用于目标基因的克隆；将具有诱导表达系统的质粒转化到微生物细胞中，通过质粒复制或者同源重组基因组整合的形式实现诱导表达系统在微本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种L‑阿拉伯糖诱导的启动子，其特征在于：该启动子的核苷酸序列是序列表SEQ ID NO: 2所示的序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：崔球，张杰，刘亚君，崔古贞，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37
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