本发明专利技术公开了一种用于多靶点基因扩增的Arm‑PCR引物设计方法，其是通过以下步骤实现的：a、用LAMP软件代替icubate2.0在线软件设计小片段靶基因的引物；b、将LAMP软件设计出的内引物前面的成环引物序列换成Arm‑PCR引物的通用接头序列；c、Arm‑PCR反应体系的配制；d、Arm‑PCR反应条件的设定与运行；e、Arm‑PCR产物的毛细管电泳检测。本发明专利技术采用LAMP软件设计出的引物组较多，有利于多重引物组的筛选，本发明专利技术用于多靶点基因扩增的Arm‑PCR引物设计方法，可以使小片段靶基因的Arm‑PCR引物得以成功设计，进而使Arm‑PCR多重反应变得简单可行。
【技术实现步骤摘要】
用于多靶点基因扩增的Arm-PCR引物设计方法
本专利技术属于生物
，具体的说是涉及一种用于多靶点基因扩增的Arm-PCR引物设计方法，该方法使小片段靶基因的Arm-PCR引物得以设计，进而使Arm-PCR多重反应变得简单可行。
技术介绍
扩增子拯救多重PCR(ampliconrescuemultiplexPCR，以下简称Arm-PCR)技术，其原理是针对多重PCR体系中的每个靶序列，分别设计两对套式引物，使其可以形成4种扩增引物组合；由于每个靶序列都有4种可能的扩增模式，从而使得寻找不同靶序列最佳通用的扩增条件变得简单可行，最终实现对多种靶基因的高特异性、高灵敏度的同步扩增。LAMP(Loop-MediatedIsothermalAmplification)法是2000年由Notomi等专利技术的一种新颖的恒温核酸扩增方法。该方法采用特异地识别靶序列上6个区域的4条引物(2条外引物，2条内引物)及具有链置换活性的BstDNA聚合酶，在65℃左右进行核酸的指数级扩增，其扩增效率可达109～1010个拷贝数量级。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于多靶点基因扩增的Arm-PCR引物设计方法，可以使小片段靶基因的Arm-PCR引物得以成功设计，进而使Arm-PCR多重反应变得简单可行。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种用于多靶点基因扩增的Arm-PCR引物设计方法，其是通过以下步骤实现的：a、用LAMP软件代替icubate2.0在线软件设计小片段靶基因的引物：将靶基因片段的序列导入LAMP软件中，按照Arm-PCR引物设计的参数对LAMP软件中的参数进行调整；b、将LAMP软件设计出的内引物前面的成环引物序列换成Arm-PCR引物的通用接头序列：icubate2.0在线软件设计出的第一轮引物分为外向引物与内向引物，这与LAMP软件设计出的引物相似，所以将LAMP软件设计出的内引物前面的成环引物序列换成Arm-PCR引物的通用接头序列，从而转换成Arm-PCR引物；c、Arm-PCR反应体系的配制；d、Arm-PCR反应条件的设定与运行；e、Arm-PCR产物的毛细管电泳检测：在Arm-PCR第二步扩增所需要的超级引物的5’端要加上荧光标记，才能进行后续的毛细管电泳检测。以转基因大豆GTS40-3-2NOS终止子和转基因大豆A5547-127为例，引物组是由LAMP软件设计的，将其内向上下游引物的成环引物换成Arm-PCR引物的通用接头序列，从而转换成Arm-PCR引物，其引物组包括正向外引物Fo、反向外引物Ro、正向内引物Fi、反向内引物Ri，用于Arm-PCR的第一步扩增；5’端ROX标记的超级上游引物Fs和下游引物Rs用于Arm-PCR的第二步扩增，其接头序列与超级引物的序列相同，核苷酸序列分别如下所示：1.A5547-127正向外引物Fo：CACAAGAGTGGATTGATGATCTAG；A5547-127反向外引物Ro：CTCATGCAACCTAACAGATGG；A5547-127正向内引物Fi：GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACGGTTGGTTGCTGAGGTTG；A5547-127反向内引物Ri：CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTGCCTATAACAGCAACCACAG；2.GTS40-3-2NOS终止子正向外引物Fo：CAAACATTTGGCAATAAAGTTT；GTS40-3-2NOS终止子反向外引物Ro：CTAGTAACATAGATGACACCG；GTS40-3-2NOS终止子正向内引物Fi：GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACAGATTGAATCCTGTTGCC；GTS40-3-2NOS终止子反向内引物Ri：CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTTATTTTGTTTTCTATCGCGTATT；3.超级上游引物Fs：GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTAC；超级下游引物Fs：CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGT；利用Arm-PCR检测引物组进行Arm-PCR反应，包括如下步骤：以转基因大豆A5547-127和转基因大豆GTS40-3-2NOS终止子的质粒为模板；PCR扩增反应：在PCR管中配制第一步反应体系：引物液2.5μl，反应液Mix12.5μl，转基因大豆A5547-127和GTS40-3-2NOS终止子质粒各2～5μl，用灭菌去离子水补齐到25μl；设置空白对照反应时，用双蒸水代替模板；将配制好的PCR管混匀后离心，并于95℃15min，94℃30s，60℃90s，72℃60s，15个循环；94℃15s，70℃90s，6个循环；60℃延伸30min，最后4℃保存；第二步PCR反应体系为：超级引物液1μl，反应液Mix12.5μl，第一步PCR反应产物1～2μl，用灭菌去离子水补齐到25μl；将配制好的PCR管混匀后离心，并于95℃15min；94℃30s，60℃90s，72℃60s，30个循环；60℃延伸30min，最后4℃保存；结果判断：通过毛细管电泳检测Arm-PCR扩增结果。本专利技术的有益效果是：icubate2.0开放平台是网上的免费多重PCR试剂设计软件，由于icubate2.0软件对靶基因的长度有要求，通常在1000bp以上，这样对于小片段的靶基因就无法设计Arm-PCR引物，且icubate2.0软件设计出的Arm-PCR引物只有两组，从而限制了多重引物组的筛选。而LAMP软件设计出的引物也包含2条外引物和2条内引物，与icubate2.0软件设计出的Arm-PCR引物相似，只要将LAMP软件设计出的内向上下游引物的成环引物换成Arm-PCR引物的通用接头序列，从而转换成Arm-PCR引物。而且LAMP软件设计出的引物组较多，有利于多重引物组的筛选，本专利技术用于多靶点基因扩增的Arm-PCR引物设计方法，可以使小片段靶基因的Arm-PCR引物得以成功设计，进而使Arm-PCR多重反应变得简单可行。附图说明图1是实施例1转基因大豆A5547-127的Arm-PCR毛细管电泳检测结果图；图2是实施例1GTS40-3-2NOS终止子的Arm-PCR毛细管电泳检测结果图；图3是空白对照组的毛细管电泳检测结果。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例对本专利技术作进一步的说明，但并不局限于此。实施例1：一种用于多靶点基因扩增的Arm-PCR引物设计方法，其是通过以下步骤实现的：a、用LAMP软件代替icubate2.0在线软件设计小片段靶基因的引物：将靶基因片段的序列导入LAMP软件中，按照Arm-PCR引物设计的参数对LAMP软件中的参数进行调整；b、将LAMP软件设计出的内引物前面的成环引物序列换成Arm-PCR引物的通用接头序列：icubate2.0在线软件设计出的第一轮引物分为外向引物与内向引物，这与LAMP软件设计出的引物相似，所以将LAMP软件设计出的内引物前面的成环引物序列换成Arm-PCR引物的通用接头序列，从而转换成Arm-PCR引物；c、Arm-PCR反应体系的配制；d、Arm-PCR反应条件的设定与运行；e、Arm-PCR产物的毛细管电泳检测：在Arm-PCR第二步扩增所需要的超级引物的5’端要本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于多靶点基因扩增的Arm‑PCR引物设计新方法，其特征在于：所述用于多靶点基因扩增的Arm‑PCR引物设计新方法是通过以下步骤实现的：a、用LAMP软件代替icubate2.0在线软件设计小片段靶基因的引物：将靶基因片段的序列导入LAMP软件中，按照Arm‑PCR引物设计的参数对LAMP软件中的参数进行调整；b、将LAMP软件设计出的内引物前面的成环引物序列换成Arm‑PCR引物的通用接头序列：icubate2.0在线软件设计出的第一轮引物分为外向引物与内向引物，这与LAMP软件设计出的引物相似，所以将LAMP软件设计出的内引物前面的成环引物序列换成Arm‑PCR引物的通用接头序列，从而转换成Arm‑PCR引物；c、Arm‑PCR反应体系的配制；d、Arm‑PCR反应条件的设定与运行；e、Arm‑PCR产物的毛细管电泳检测。
【技术特征摘要】
1.一种用于多靶点基因扩增的Arm-PCR引物设计方法，其特征在于：所述用于多靶点基因扩增的Arm-PCR引物设计方法是通过以下步骤实现的：a、用LAMP软件代替icubate2.0在线软件设计小片段靶基因的引物：将靶基因片段的序列导入LAMP软件中，按照Arm-PCR引物设计的参数对LAMP软件中的参数进行调整；b、将LAMP软件设计出的内引物前面的成环引物序列换成Arm-PCR引物的通用接头序列，从而转换成Arm-PCR引物；c、Arm-PCR反应体系的配制；d、Arm-PCR反应条件的设定与运行；e、Arm-PCR产物的毛细管电泳检测；引物组包括正向外引物Fo、反向外引物Ro、正向内引物Fi、反向内引物Ri，用于Arm-PCR的第一步扩增；5’端ROX标记的超级上游引物Fs和下游引物Rs用于Arm-PCR的第二步扩增；利用Arm-PCR检测引物组进行Arm-PCR反应，包括如下步骤：以转基因大豆A5547-127和转基因大豆GTS40-3-2NOS终止子的质粒为模板；PCR扩增反应：在PCR管中配制第一步反应体系：引物液2.5μl，反应液Mix12.5μl，转基因大豆A5547-127和GTS40-3-2NOS终止子质粒各2～5μl，用灭菌去离子水补齐到25μl；设置空白对照反应时，用双蒸水代替模板；将配制好的PCR管混匀后离心，并于95℃15min，94℃30s，60℃90s，72℃60s，15个循环；94℃15s，70℃90s，6个循环；60℃延伸30min，最后4℃保存；第二步PCR反应体...
【专利技术属性】
技术研发人员：方雪恩，王丽娟，陈旭，徐凌佳，孔继烈，
申请(专利权)人：上海速芯生物科技有限公司，复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。