本发明专利技术提供一种能反映运动员过度训练情况的人血浆游离DNA水平的定量PCR检测方法，该方法的扩增引物特别设计，选用人类基因中表达最丰富的Alu重复序列基因，敏感性更高，无需DNA抽提。在训练前、训练后即刻采血，选择指尖血或静脉血20μl，肝素或EDTA抗凝。离心、收集血浆。将作为标准品的DNA和5倍稀释的各样本血浆加入定量PCR的反应体系：MaximaSYBRGreen/ROXqPCRMasterMix(2x)，12.5μl；正向和反向引物(50μM)，各0.2μl；标准品或5倍稀释后的样品，各1.0μl；不含DNA酶的水，11.1μl。根据标准品的浓度计算出样品的游离DNA水平。比较训练前、训练后即刻的血浆游离DNA水平，若几倍到数十倍增加可能是过度训练者。我们的定量PCR方法能作为血浆游离DNA水平的检测方法，能反映运动员的过度训练情况。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术旨在提供一种能反映运动员过度训练情况的人血浆游离DNA水平的定量PCR检测方法，该方法的扩增引物特别设计，只需一滴指尖或静脉血、无需DNA抽提、3小时就可检测出血浆游离DNA水平。若想数值能更准确，以及动态反应过度训练过程，可以选择训练前、训练后即刻以及训练后的不同时间来指尖采血或静脉抽血，检测血浆游离DNA的水平，动态观察和比较。
技术介绍
目前检测血浆游离DNA水平的方法有彗星检测或称为单细胞凝胶电泳试验、血浆DNA的荧光定量测定和定量PCR方法。第一种方法的长处是可检测单细胞水平的DNA损伤，但取材到的细胞不一定能反映血浆总的DNA损伤程度；第二种方法要进行血浆DNA的抽提之后才可进行，且敏感性不是很高，而第三种的定量PCR方法所选用的扩增基因有肌肉生长抑制素基因（扩增片段88bp）、β球蛋白基因（扩增片段189bp）和多位点L1PA2基因（扩增片段90bp和222bp）的扩增，尽管它们的敏感性高，但大多也需先进行血浆或血清的DNA抽提才能有较好的扩增结果。在应用中需要一种用血量少且无需进行血浆DNA抽提的测试方法。目前，应用七大类生理指标（血睾酮水平、皮质醇水平，睾酮/皮质醇比值，晨脉，Hb水平，血尿素、血清肌酸激酶）的综合评定来反映是否出现过度训练及过度训练的程度，但这些指标均没有特异性、且常常滞后，不能早期、敏感、准确地反映运动员过度训练情况。因此，体育界非常迫切地希望有某种分子能成为反映过度训练的早期、敏感监测指标，并且检测方法简便、快速、需血量少。近年来的研究显示，血浆游离DNA的水平是一个很好的候选分子。自1982年首次报道了运动通过增多的自由基损伤组织，引起DNA断裂，使血中出现游离DNA（cellfreeDNA）（DaviesKJ,QuintanilhaAT,BrooksGA,etal.Freeradicalsandtissuedamageproducedbyexercise.BiochemBiophysResCommun.1982;107(4):1198-205.运动产生的自由基和组织损伤。生物化学和生物物理研究通讯。）之后，近几年来关于运动对血浆游离DNA的影响及意义越来越受到研究者的关注。目前的研究认为不论是一次的大强度训练（1.AtamaniukJ,VidottoC,TschanH,etal.Increasedconcentrationsofcell-freeplasmaDNAafterexhaustiveexercise.ClinChem.2004;50(9):1668-70.力竭运动后血浆游离DNA的浓度增加。临床化学。2.AtamaniukJ,StuhlmeierKM,VidottoC,etal.Effectsofultra-marathononcirculatingDNAandmRNAexpressionofpro-andanti-apoptoticgenesinmononuclearcells.EurJApplPhysiol.2008;104(4):711-7.马拉松对单核细胞促凋亡和抗凋亡的游离DNA和mRNA的影响。欧洲应用生理学杂志。3.BeiterT1,FragassoA,HudemannJ,etal.Short-termtreadmillrunningasamodelforstudyingcell-freeDNAkineticsinvivo.ClinChem.2011;57(4):633-636.短期的跑台跑步运动是一个研究体内游离DNA动态变化的模型。临床化学。4.VeldersM1,TreffG1,MachusK1,etal.ExerciseisapotentstimulusforenhancingcirculatingDNaseactivity.ClinBiochem.2014;47(6):471-474.运动是一个增强循环DNA酶活性的潜在刺激因素。临床生化。5.AtamaniukJ,VidottoC,KinzlbauerM,etal.Cell-freeplasmaDNAandpurinenucleotidedegradationmarkersfollowingweightliftingexercise.EurJApplPhysiol.2010;110(4):695-701.举重后的血浆游离DNA和嘌呤核苷酸降解标记物。欧洲应用生理学杂志。），还是持续一段时间（慢性）的大强度或大负荷训练（1.FatourosIG,DestouniA,MargonisK,etal.Cell-freeplasmaDNAasanovelmarkerofasepticinflammationseverityrelatedtoexerciseovertraining.ClinChem.2006;52(9):1820-4.血浆游离DNA是一个与过度训练有关的反映无菌性炎症严重程度的新标记。运动医学。2.BreitbachS1,TugS,SimonP.Circulatingcell-freeDNA:anup-comingmolecularmarkerinexercisephysiology.SportsMed.2012;42(7):565-86.循环中的游离DNA：一个将来的运动生理学的分子标记。运动医学。）都可使血浆游离DNA的水平迅速（多在运动后的数分钟到一、二小时内）升高，且增加幅度明显（从几倍到几十、上百倍不等）。如果是单次的大强度运动则血浆游离DNA清除较快，通常在12小时内恢复正常，而慢性的大强度和大负荷运动则升高的游离DNA水平维持较久，从1天到十来天不等，由运动强度和负荷决定（1.FatourosIG,DestouniA,MargonisK,etal.Cell-freeplasmaDNAasanovelmarkerofasepticinflammationseverityrelatedtoexerciseovertraining.ClinChem.2006;52(9):1820-4.血浆游离DNA是一个与过度训练有关的反映无菌性炎症严重程度的新标记。运动医学。2.BreitbachS1,TugS,SimonP.Circulatingcell-freeDNA:anup-comingmolecularmarkerinexercisephysiology.SportsMed.2012;42(7):565-86.循环中的游离DNA：一个将来的运动生理学的分子标记。运动医学。）。已发现多种运动方式，如马拉松（1.AtamaniukJ,VidottoC,TschanH,etal.Increasedconcentrationsofcell-freeplasmaDNAafterexhaustiveexercise.ClinChem.2004;50(9):1668-70.力竭运动后血浆游离DNA的浓度增加。临床化学。2.AtamaniukJ,StuhlmeierKM,VidottoC,etal.Effectsofultra-marathononcirculatingDNAandmRNAexpressionofpro-本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用Alu重复序列基因扩增引物且无需DNA抽提的检测血浆游离DNA的定量PCR方法，其特征是选用人类基因中表达最丰富的Alu重复序列基因，设计的扩增引物是：正向：5’‑atcctggctaacacggtgaa ‑3’，反向5’‑gatctcggctcactgcaag‑3’ 扩增产物152 bp；在训练前、训练后即刻采血，选择指尖血或静脉血20μ，肝素或EDTA抗凝，离心、收集血浆，血浆稀释5倍；无需DNA抽提进行定量PCR扩增；比较训练前、训练后即刻的血浆游离DNA水平。
【技术特征摘要】
1.一种用Alu重复序列基因扩增引物且无需DNA抽提的检测血浆游离DNA的定量PCR方法，其特征是选用人类基因中表达最丰富的Alu重复序列基因，设计的扩增引物是：正向：5’-atcctggctaacacggtgaa-3’，反向5’-gatctcggctcactgcaag-3’扩增产物152bp；在训练前、训练后即刻采血，选择指尖血或静脉血20μ，肝素或EDTA抗凝，离心、收集血浆，血浆稀释5倍；无需DNA抽提进行定量PCR扩增；比较训练前、训练后即刻的血浆游离DNA水平。
2.根据权利要求1所述的用Alu重复序列基因扩增引物且无需DNA抽提的检测血浆游离DNA的定量PCR方法，其特征在于定量PCR的反应体系：MaximaSYBRGreen...
【专利技术属性】
技术研发人员：王晓慧，
申请(专利权)人：上海体育学院，
类型：发明
国别省市：上海;31
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