本发明专利技术属于分子生物学和医学检验技术领域，涉及一种同时测定人他克莫司作用靶点信号通路系列蛋白编码基因多态性的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱方法。本发明专利技术对样本进行DNA提取后，进行多重PCR扩增，单碱基延伸反应后，应用飞行时间质谱方法进行对样品进行基因分型分析。所述方法操作简便、无需序列特异性探针，可对多个样本多重检测，每个体系可实现40重反应，同时检测40个SNP位点，具有高通量，适用范围广，同时检测多至成千上万个样本，几十到成百上千个位点；无需荧光标记，仅需合成普通引物，单个分析成本低；高灵活度，分析所需样本量少，高灵敏度，检测精度高。适合临床常规基因检测，进一步为临床个体化合理用药提供技术支撑。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学技术和医学检验领域，涉及他克莫司作用靶点基因多态性 的测定方法，具体涉及他克莫司的作用靶点信号通路系列蛋白编码基因多态性的检测方 法。
技术介绍
据研究报道，他克莫司治疗窗窄，疗效存在显著个体差异，目前，临床上通常采用 通过对其进行治疗药物监测（therapeuticdrugmonitoring，TDM)，即监测血药浓度，进行 调整他克莫司的剂量。实践显示，传统的TDM难以从药效学的角度反映个体之间的变异，而 且TDM只有在服药后方可实施，无法在服药前预测机体对药物的反应，药物的初始剂量难 以确定。因此，单纯依靠TDM进行他克莫司的个体化治疗显然是不够的，临床实践中迫切需 要寻找新的个体化治疗干预策略。 现有技术公开了遗传变异是导致药物效应个体间变异的最主要因素之一。通过 研究遗传变异与药物反应的关系，可根据基因型制定药物的初始剂量，也可以筛选药物反 应敏感或无效的特定人群，进行个体化治疗，因此，药物基因组学是个体化药物治疗发展 的新台阶。至2014年8月，FDA已经批准或修订138种药物说明书，建议检测基因型，以 提高药物使用的有效性和安全性（http://www.fda.gov/% 20drugs/scienceresearch/ researchareas/pharmacogenetics/ucm083378.htm)〇 有研究公开了他克莫司在体内的作用靶点和通路，他克莫司进入T细胞后与一种 免疫亲和素一FK506 结合蛋白（FK506bindingprotein，FKBP)相结合，FKBP-FK506 复合 物专一1性地结合以及抑制I丐调磷酸酶（calcineurin，CaN)活性，阻断活化T细胞核转录因 子（nuclearfactorofactivatedTcell，NFAT)的去磷酸化，进而抑制IL-2的基因转 录，从而抑制T细胞的后续活化。研究显示，他克莫司作用信号通路的重要分子（FKBP、CaN 及NFAT)的功能状态，对于他克莫司药理作用的发挥，具有至关重要的作用，他克莫司作用 靶点信号通路中的FKBP、CaN及NFAT蛋白编码基因的单核苷酸多态性，影响基因功能，进而 影响他克莫司与FKBP、FKBP与CaN、CaN与NFAT、以及NFAT与靶基因的相互结合，最终影响 他克莫司的免疫抑制作用。 FKBP属免疫亲和素的一个亚类，其家族成员有20多个，其中最重要的是FKBP12、 FKBP12. 6,其编码基因分别为FKBP1A和FKBP1B;CaN以异二聚体的形式存在，由61ku的催 化亚基CalcineurinA(CNA)和19ku的调节亚基CalcineurinB(CNB)组成；其中的CNA有 CNAa、CNAβ和CNAγ三个亚型，其编码基因分别为PPP3CA、PPP3CB和PPP3CC;CNB有CNB1 和CNB2两个亚型，其编码基因分别是PPP3R1和PPP3R2 ;研究显示，CNAaΧΝΑβ及CNB1在 体内广泛表达，CNAy和CNB2只存在于大脑和睾丸中；NFAT属于Rel蛋白家族，Rel蛋白 家族包括NF-kB及NFAT，是保守的DNA结合域；NFAT有5种亚型，分别是NFATC1、NFATC2、 NFATC3、NFATC4、NFAT5,其中NFATC1、NFATC2、NFATC3主要存在于T淋巴细胞等免疫细胞 中，NFATC4存在于包括心脏在内的其他组织细胞中，NFAT5不同于其他4种蛋白，不受细胞 内钙离子浓度的调节，主要通过激活高渗诱导的肿瘤坏死因子（TNF)基因转录，参与T细胞 生长、发育的调节。研究显示，CaN-NFAT信号通路在免疫系统与非免疫系统中均发挥重要 的作用，因此检测他克莫司靶点通路基因的遗传变异对预测他克莫司药物反应具有较重要 的临床意义。 已知药物在体内最终效应的发挥受到多个环节的影响，其包括药动学和药效学环 节，而药动学和药效学又各自受到多种酶、转运蛋白、受体、信号通路等的影响，而每种受 体、蛋白等的编码基因，又存在多个SNP位点，因此，仅仅通过检测一种基因的一个SNP位点 的基因型，对解释药物的个体差异，显然是远远不够的，因此，往往需要同时检测多个基因 多个SNP位点，对解释药物的个体差异能提供有意义的参考依据。 目前，基因多态性的检测方法主要有DNA直接测序法和Taqman探针法等，所述DNA 直接测序法是目前突变检测的金标准，但存在费时费力，成本较昂贵等缺陷，是一种低通量 的检测方法，不适用于大量样本检测；所述Taqman是高度特异的定量PCR技术，其特点是 适应于大样本少量SNP位点检测，是一种中等通量的SNP检测，而对于同时检测多个SNP位 点，则费用较高，不适宜。 基于现有技术的现状，本申请的专利技术人拟提供一种高效、灵敏、准确的，能同时检 测多个SNP位点的方法，该方法适应于大样本或小样本，进一步为协助个体化给药、保证用 药安全和有效提供技术支撑。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术存在的缺陷，提供一种同时测定人他克莫司作用 靶点基因多态性的方法，具体涉及一种同时测定他克莫司作用靶点通路系列蛋白编码基因 多个SNP位点基因型的方法。 本专利技术基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-AssistedLaser Desorption/IonizationTimeofFlightMassSpectrometry，MALDI-T0FMS)方法同时 测定人他克莫司作用靶点信号通路系列蛋白编码基因多态性，尤其采用MALDI-T0FMS方法 同时检测他克莫司的作用靶点信号通路上FK506结合蛋白、钙调磷酸酶、活化T细胞核转录 因子的编码基因多态性。该方法能高效、灵敏、准确的同时检测他克莫司作用靶点信号通路 中的多个蛋白编码基因中的多个SNP位点的基因型，为解释临床他克莫司药效的个体差异 提供重要依据，进一步指导他克莫司的临床个体化给药干预策略。 本专利技术方法中采用时间飞行质谱（MALDI-T0F)方法，首先通过PCR扩增含有SNP的基因组片段，然后通过序列特异性引物实现单碱基延伸，随后样品分析物与芯片基质共 结晶后在真空管中受瞬时纳秒（l〇-9s)强激光激发，核酸分子因此解吸附成为单电荷离 子，由于电场中离子飞行时间与离子质量成反比，通过检测核酸分子在真空管中的飞行时 间获得样品分析物的精确分子量，从而检测出SNP位点信息。本方法适用于同时检测同一 样本多个SNP位点。 更具体的，本专利技术的，其特 征在于，对待测样品基因组DNA提取，经PCR扩增后，SAP处理、单碱基延伸后，产物纯化，用 飞行时间质谱仪进行检测，进行基因分型， 通过以下步骤： (1)设计序列特异性引物 查找目的基因的DNA序列，针对目的基因的突变位点设计筛选合适的引物对；并 根据不同的位点，组合成不同的PCR反应体系； ⑵提取外周血细胞样本的基因组DNA，利用步骤⑴筛选的引物进行基因扩增； (3)扩增的PCR产物进行SAP处理，进行单碱基延伸反应，纯化后得样品分析物； (4)样品分析物点样至芯片基质，用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行分 析，获得样品分析物的分子量，检出SNP位点信息，完成基因分型分析。 本专利技术步骤本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种同时测定人他克莫司作用靶点基因多态性的方法，其特征在于，对待测样品基因组DNA提取，经PCR扩增后，SAP处理、单碱基延伸后，产物纯化，用飞行时间质谱仪进行检测，进行基因分型，通过以下步骤：(1)设计序列特异性引物查找目的基因的DNA序列，针对目的基因的突变位点设计筛选合适的引物对；并根据不同的位点，组合成不同的PCR反应体系；(2)提取外周血细胞样本的基因组DNA，利用步骤(1)筛选的引物进行基因扩增；(3)扩增的PCR产物进行SAP处理，进行单碱基延伸反应，纯化后得样品分析物；(4)样品分析物点样至芯片基质，用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行分析，获得样品分析物的分子量，检出SNP位点信息，完成基因分型分析。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邱晓燕，徐勤霞，焦正，钟明康，
申请(专利权)人：复旦大学附属华山医院，
类型：发明
国别省市：上海;31
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。