拟茎点霉GPDH基因扩增引物及其设计方法和应用技术

本发明专利技术公开了拟茎点霉GPDH基因扩增引物及其设计方法和应用。本发明专利技术设计的是针对拟茎点霉属真菌的通用引物。其上游引物PGP-f有47个碱基：CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGCCGTCAACGACCCCTTCATTGA，下游引物PGP-r有48个碱基：AGCGGATAACAATTTCACACAGGAGGGTGGAGTCGTACTTGAGCATGT。本发明专利技术设计的GPDH引物对拟茎点霉属通用性强，扩增片段包含丰富的信息位点，拥有更高的种间变异率及更小的种内变异率，可用于构建系统发育树、物种分类鉴定、种群进化等研究，为拟茎点霉检疫鉴定工作提供了重要工具。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术设计拟茎点霉真菌鉴别
，具体的说，设及拟茎点霉GPDH基因扩增 引物及其设计方法和应用。
技术介绍
拟茎点霉属(Phomopsis(Sacc.化ubak)真菌是重要的植物病原菌和植物内生菌， 其有性态为间座壳属(Diapodhe)，主要集中在热带和亚热带地区。拟茎点霉属真菌是农业 和林业上重要的病原菌，寄主植物多达74科，可引起多种植物病害，例如溃瘍、果腐、叶枯、 枝枯、根腐、树皮坏死等。此外，该属的部分种类还是植物的重要内生菌和腐生菌，在自然生 态系统中占有非常重要的地位。 传统形态学方法一直是真菌分类鉴定的基础，但由于拟茎点霉表型特征具有较高 的相似性，因而难W精准鉴定。早期对拟茎点霉种级分类研究主要W寄主植物属为基础，但 拟茎点霉部分种类没有寄主专化性，他们可W同时侵染几个属甚至不同科的植物，因此W 寄主作为该属真菌的分类依据并不准确。 3-憐酸甘油脱氨酶（glyceraldehyde-3-地OS地ate dehy化ogenase，GPDH)是甘油 产生途径的关键酶，参与糖酵解过程中第一个ATP的形成，使3-憐酸甘油醒转变为1，3-二 憐酸甘油醒。同时，GPDH基因还具有抵抗逆境胁迫的功能，当活细胞处在各种环境压力的 条件下，例如高溫、高盐、低溫等胁迫，其基因表达模式将发生改变。由于GPDH属于组成型表 达，且易于扩增，故广泛用作内参基因使用。研究表明真菌GPDH基因包含十分丰富的信息位 点，拥有更高的种间变异率及更小的种内变异率，可用于构建系统发育树、物种分类鉴定、 种群进化等研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一对高效的拟茎点霉GPDH基因扩增引物。 本专利技术的另一个目的是提供上述引物的设计方法。 本专利技术的进一步目的是提供上述引物在拟茎点霉种类鉴定、地理种群鉴别和检验 检疫中的应用。[000引本专利技术设计的拟茎点霉GPDH基因扩增引物，其上游引物PGP-f有47个碱基： CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGCCGTCAACGACCCCTTCATTGA，下游引物PGP-r有48个碱基： AGCGGATAACAATTTCACACAGGAGGGTGGAGTCGTACTTGAGCATGTo 本专利技术的拟茎点霉GPDH基因扩增引物设计的步骤为:登陆GenBank捜索目前已测 定全序列的60种拟茎点霉GPDH基因，去掉不完全和部分的序列，寻找保守序列，并在5 '端加 入测序序列，从而获得一对通用引物：其上游引物P G P - f有4 7个碱基： CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGCCGTCAACGACCCCTTCATTGA，下游引物PGP-r有48个碱基： AGCGGATAACAATTTCACACAGGAGGGTGGAGTCGTACTTGAGCATGT。扩增片断大小在 230bp 左右。 可扩增拟茎点霉属真菌GPDH基因的通用引物PCR反应体系和反应条件如下： (l)PCR反应体系：共25化，内含2X Taq MasterMix 12.扣L、10yM的引物PGP-f和引 物PGP-r各化L、含50~15化g的DNA模板溶液化L、d地20 9.5化。（2)扩增条件:94°(3预变 性3min，然后94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸60s，共35个循环，最后在72°C充分延伸 lOmin。扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测其大小、纯度及亮度。[001。 本专利技术所述的拟茎点霉GPDH基因增引物可扩增拟茎点霉GPDH基因片段，能获得单 一的目的片段，产物大小为230bp左右，并可对PCR扩增产物进行直接测序。其步骤为:PCR 扩增产物经初步定量后，浓度达lOOng/化的样品委托公司进行双向直接测序，测序引物为 Μ13Ρ-47(10μΜ)和Κν-Μ(ΙΟμΜ)，序列分析仪为ABI 3730型全自动DNA测序仪。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果:本专利技术的拟茎点霉GPDH基因扩增引 物对我国常见拟茎点霉真菌GPDH基因进行扩增，均能获得单一的目的DNA片断，特异性扩增 产物大小为23化P左右，经测序及与GenBank上同源序列的比较，证实为拟茎点霉GPDH基因 的扩增产物。GPDH基因信息位点丰富，种间变异率较高，利用本专利技术设计的引物与ITS引物 联合使用，可W准确鉴定某些难于鉴别的近缘物种，为口岸检疫工作提供了重要的工具。【附图说明】 图1、图2均为PGP-f/PGP-r扩增不同拟茎点霉GPDH基因的电泳图谱。 其中M:DNA分子量标准（2000bp DNA Ladder)，N:阴性对照，1-32:依次为扁桃拟 茎点霉（Phomopsis amygdaliana)、梨干枯拟茎点霉（Phomopsis fukushii)、大豆拟茎点种 腐病菌（Phomopsis longicolla)、苹果拟茎点菌（Phomopsis mali)、芒果拟茎点霉 (Phomopsis man邑iferae)、叶下珠生拟茎点霉(Phomopsis phyllanthicola)、柿苗拟茎点 霉（Phomopsis rojana)、茶溃瘍拟茎点霉（Phomopsis theae)、茎生拟茎点霉（Phomopsis trunci col a)、石恼干腐菌（Phomopsis verson i ana)、葡萄生拟茎点霉菌（Phomopsis viticola)、芦算拟茎点霉(Phomopsis aspara邑i)、糕竹拟茎点霉(Phomopsis rhapidis)、 茄褐纹拟茎点霉（Phomopsis vexans)、精拟茎点霉（Phomopsis cinnamom)、蔓绿绒拟茎点 霉（Phomopsis philoden化i)、花烛拟茎点霉（Phomopsis anthurii)、黄瓜黑色根腐病菌 (Phomopsis sclerotioides)、栗拟茎点霉（Phomopsis castanea)、柿拟茎点霉（Phomopsis diospyr)、茵香拟茎点霉（Phomopsis foeniculi)、十字花拟茎点霉（Phomopsis cruciferae)、杏拟茎点霉（Phomopsis amy 邑 da 1 i )、荷麻拟茎点霉(Phomopsis abutilonis)、仙人掌拟茎点霉（Phomopsis cacti)、橡胶拟茎点霉（陆omopsis heveae)、小 麦拟茎点霉（Phomopsis conhoversa)、越橘果腐病（Phomopsis.vaccinii)、石恼干腐菌 (化omopsis .versoniana)、石恼干腐菌（Phomopsis . versoniana)、木犀拟茎点霉 (化omopsis . osmanthi )、木兰生拟茎点霉（Phomopsis .magnol i icola)、柳拟茎点霉 (Phomopsis.salicina)。【具体实施方式】 登陆GenBank捜索目前已测定全序列的60种拟茎点霉GP畑基因，去掉不完全和部 分的序列，寻找保守序列，并在5'端加入测序序列，从而获得一对通用引物：其上游引物 PGP-f 有 47 个碱基：CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGCC本文档来自技高网...

【技术保护点】
拟茎点霉GPDH基因扩增引物，其特征是将测序序列和扩增序列结合在一起，其上游引物PGP‑f有47个碱基：CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGCCGTCAACGACCCCTTCATTGA，下游引物PGP‑r有48个碱基：AGCGGATAACAATTTCACACAGGAGGGTGGAGTCGTACTTGAGCATGT。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡佳续，郭京泽，刘鹏，张瑞峰，廖芳，林宇，黄国明，牛春敬，
申请(专利权)人：天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，
类型：发明
国别省市：天津;12