FoxO1基因在药物制备中的应用制造技术

本发明专利技术属于生物医药领域，特别涉及FoxO1基因在药物制备中的应用，本发明专利技术是研究FoxO1基因在高糖情况下，对成骨细胞增殖分化中的作用，进而研究了FoxO1基因糖尿病所致的骨损伤及骨质疏松中所起的作用，为临床上治疗糖尿病性骨损伤及骨质疏松疾病提供了理论依据和实验数据。本发明专利技术验证了FoxO1基因可促进成骨细胞增殖，FoxO1作为主要调控骨量的因子且在成骨细胞具有抗氧化应激的作用，其在无论是衰老引起，或是糖尿病高血糖引起的氧化应激水平增高的环境中，都对骨质疏松症的发生起到了一定的保护作用，为抗骨质疏松新药的研发提供了新靶点。

【技术实现步骤摘要】
FoxOI基因在药物制备中的应用
本专利技术属于生物医药领域，特别涉及FoxOl基因在药物制备中的应用。
技术介绍
糖尿病患者异常的高水平葡萄糖可导致许多慢性并发症的发生。研究表明，糖尿病可以诱发钙、磷和骨代谢发生改变，从而使患者骨折率增加、并延迟其骨折愈合，影响其生活质量。糖尿病并发症发生机制的一个主要假说是由于糖尿病诱发的氧化应激增加，因为活性氧(ROS)在糖尿病状态下会增多，并且ROS已被证实能够诱使多种细胞功能障碍。氧化应激由多种机制所诱导，包括高级糖基化终末产物(AGEs)形成增加、多元醇通路通量增加、蛋白激酶C亚型的激活、葡萄糖自氧化以及糖尿病状态下线粒体超氧化物的产生过剩等。糖尿病中其他循环因子升高例如游离脂肪酸和瘦素，也能引起ROS生成增加。而临床研究也表明葡萄糖对骨代谢有着直接的作用，糖尿病患者血糖控制不佳时，会出现高血钙和骨丢失。临床资料显示，和糖尿病相关的骨质疏松是因为骨形成减少，而非骨吸收增加。对8名糖尿病伴有低骨量的患者进行组织形态学检查发现，患者的骨形成速率仅为健康人的24%。哺乳动物包括人类的成熟骨骼通过成骨细胞引起骨形成，而前成骨细胞在成熟过程中，经历了一系列分化阶段，如增殖，基质形成和基质矿化。成骨细胞在逐渐表现出特有的成骨表型的过程中，伴有成骨特有基因的上调和下调。增殖阶段的主要特征是在成骨细胞成熟阶段的基因表达在这一阶段最少，从增殖阶段转变为基质分化阶段，调控基质形成和基质成熟的基因开始上调，其中以碱性磷酸酶表达得最早。当成骨细胞成熟阶段特有的基因开始表达时，成骨细胞的增殖速率减慢，而基质开始沉积并趋向成熟。碱性磷酸酶的表达在基质成熟阶段达到最大值，随后在基质矿化时的后期阶段开始下降。骨钙素的表达开始增高标志着矿化阶段的开始，同时该阶段伴有钙的沉积，最终骨钙素和钙沉积在矿化阶段达到最大值。 因此，如果能研究出成骨细胞增殖分化能力的影响因素，制备出对治疗糖尿病所致的骨损伤，或是骨质疏松的药物，对糖尿病患者而言是一种极大的福利。
技术实现思路
本专利技术的目的是研究FoxOl基因在高糖情况下，对成骨细胞增殖分化中的作用，进而研究了 FoxOl基因糖尿病所致的骨损伤及骨质疏松中所起的作用，为临床上治疗糖尿病性骨损伤及骨质疏松疾病提供了理论依据和实验数据。 本专利技术涉及FoxOl在制备治疗糖尿病所致的骨损伤药物中的应用。 本专利技术还涉及FoxOl在制备治疗骨质疏松药物中的应用。 本专利技术还涉及FoxOl在制备成骨细胞增殖药物中的应用。 本专利技术对高糖环境下成骨细胞增殖、分化及矿化能力与氧化应激的关系进行了实验，结果显示高糖环境下抑制成骨细胞增殖、分化及矿化能力与氧化应激密切相关。由于FoxOl是FoxO转录因子家族中在成骨细胞功能和氧化还原平衡的主要调控因子，也是一个明显调控骨量的因子，因此，本专利技术通过成骨细胞特异性敲除FoxOl基因，来观察FoxOl对高糖刺激下成骨细胞分化功能及矿化能力的影响。结果显示，在相同浓度D-葡萄糖刺激下，特异性敲除FoxOl基因的FoxOl-shRNA组的MC3T3-E1的成骨分化基因Runx2和ALP转录水平表达都较正常细胞对照组(HG组)和无关shRNA转染对照组(NC组)明显降低，且具有统计学意义，OC转录水平也有一定程度降低；虽然ALP活性FoxOl-shRNA组与HG组、NC组无明显差异，但是相比较于正常糖对照组(NG组)，FoxOl-shRNA组的ALP活性及染色均明显降低。 RT-PCR及Western Blot结果显示,在高糖刺激下FoxOl基因的mRNA及蛋白表达均有升高。而在相同高糖刺激环境下，FoxOl敲除组细胞的成骨分化能力显著降低，同时发现FoxOl蛋白表达水平明显下降，而FoxOl正常存在的成骨细胞在高糖刺激的条件下，其FoxOl蛋白水平则呈高表达状态。以上结果提示，FoxOl可能通过在一定程度上对抗高糖引起的氧化应激作用，来达到维持成骨细胞的正常分化功能。 本专利技术证实了在高糖引起的氧化应激增加的情况下，FoxOl通过其抗氧化作用维持了成骨细胞的正常分化功能。越来越多的证据显示衰老以及与年龄相关疾病的发展都与氧化应激水平增高有关，这表明氧化应激在其发病机制中起着重要的作用。类似于骨质疏松疾病的发展与成骨细胞中氧化应激水平增加相关，表明这也许是骨丢失发病机制中一个关键因素。氧化应激会导致大量活性氧(ROS)的产生，ROS水平上升会破坏蛋白质、脂质和DNA并最终导致细胞死亡。细胞通过上调清除酶或DNA损害修复基因来抵消ROS的副作用，这个反应包括了脱磷酸作用和随后的FoxO转录因子家族的激活。 综上所述，FoxOl作为主要调控骨量的因子且在成骨细胞具有抗氧化应激的作用，可见其在无论是衰老引起，或是糖尿病高血糖引起的氧化应激水平增高的环境中，都对骨质疏松症的发生起到了一定的保护作用，为抗骨质疏松新药的研发提供了新靶点。 现有技术相比，本专利技术的有益效果在于:1、本专利技术验证了 FoxOl基因和糖尿病所致的骨损伤或是骨质疏松疾病有着密切的关系，FoxOl基因可促进成骨细胞增殖，为临床上FoxOl基因的应用提供了实验数据和理论基础。2、FoxOl作为主要调控骨量的因子且在成骨细胞具有抗氧化应激的作用，其在无论是衰老引起，或是糖尿病高血糖引起的氧化应激水平增高的环境中，都对骨质疏松症的发生起到了一定的保护作用，为抗骨质疏松新药的研发提供了新靶点。 【附图说明】 图1为慢病毒侵染3T3-E1细胞后的稳转株荧光显微镜观察的结果对比图。 图2为FoxOl-shRNA转染对成骨细胞成骨分化的影响对比图 图3为Western Blot的结果显不图。 【具体实施方式】 下面结合实施例，对本专利技术作进一步说明: 实施例1 1、成骨细胞上FoxOl基因敲除 使用分别经过pcDNA3.1-FoxOl载体构建、干扰载体构建和筛选、干扰慢性病毒载体构建、干扰慢病毒包装、病毒侵入染细胞，完成在成骨细胞上的FoxOl基因敲除。 慢病毒侵染3T3-E1细胞后所建立的稳转株荧光显微镜观察结果如图1，无关shRNA转染对照组(标记为NC)及FoxOl-shRNA慢病毒转染组(标记为FoxOl-shRNA)细胞均有显著荧光表达。 2、成骨细胞的培养和诱导分化 I)成骨细胞的培养 配制含10% FBS，1%抗生素及lug/ml杀稻瘟菌素的a-MEM培养液，置于37°C水浴锅中预热20分钟；正常糖对照组(NG)、高糖组(HG)、无关shRNA转染对照组(NC)、FoxOl-shRNA慢病毒转染组(FoxOl-shRNA)MC3T3-EI分别均匀种于1cm培养皿中，摇匀，放入37°C、5% CO2培养箱中进行培养；24小时首次换液，PBS清洗后，加入新鲜培养液继续培养；3天后再次换液，以后每2-3天换液一次，约6-7天细胞集落已较大，集落之间无空白区域；去掉原培养液，0.25% Trypsin-EDTA消化，制成细胞悬液，接种于新的培养皿。取P3生长状态良好的细胞，成骨诱导细胞按3xl03/m2接种于六孔板，80-90 %汇合时，加入成骨诱导液，正常糖对照组同时加入19.5mmol/L甘露醇排除高渗本文档来自技高网...

【技术保护点】
FoxO1在制备治疗糖尿病所致的骨损伤药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.FoxOl在制备治疗糖尿病所致的骨损伤药物中的应用。2.FoxOl在制...

【专利技术属性】
技术研发人员：宁光，王筱婧，刘建民，赵红燕，孙立昊，陶蓓，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属瑞金医院，
类型：发明
国别省市：上海;31