一种串联鸭α、γ干扰素基因及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种串联鸭α、γ干扰素基因及其制备方法和应用，属于生物技术领域的基因融合表达。本发明专利技术所述的串联鸭α、γ干扰素基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明专利技术还提供了串联鸭α、γ干扰素基因的制备方法，以及表达串联鸭α、γ干扰素基因的原核表达质粒pET32a-IFNα-linker-IFNγ及其制备方法，以及串联鸭α、γ干扰素基因表达的融合蛋白在制备鸭的抗病毒药物方面的应用。本发明专利技术成功构建了重组鸭α、γ干扰素原核表达质粒pET32a-IFNα-linker-IFNγ，实现了鸭IFN-α和IFN-γ基因在大肠杆菌原核表达系统上的串联表达，还可以保证两个干扰素基因以1:1的比例进行表达。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
的基因融合表达，具体涉及一种串联鸭α、γ干扰素基因及其制备方法和应用。
技术介绍
干扰素(interferon,IFN)是一类在同种细胞上具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种生物学功能的糖蛋白。1957年，由Isaacs等首次发现。国际干扰素命名委员会根据干扰素的抗原特性和分子结构的差异，将干扰素分为2个型。α干扰素(IFN-α)属I型干扰素，在1995年，由Schultz等成功克隆并表达，随后，研究者相继克隆出北京鸭、番鸭、麻鸭和绍兴鸭的IFN-α基因。IFN-α基因由576个核苷酸构成，共编码191个氨基酸，含有信号肽。不同品种间的鸭α干扰素基因相对较保守，核苷酸序列同源性在99.5％～100％之间。IFN-α主要参与抗病毒、抗肿瘤过程，研究表明，重组鸭IFN-α对DHV有一定的治疗作用，可以减少乙肝病毒cccDNA向pgRNA的转录。此外，重组鸭α干扰素对流感病毒、新城疫病毒和呼肠孤病毒也有一定的抑制作用。γ干扰素(IFN-γ)属于II型干扰素，1999年，Schultz等证明了鸭IFN-γ开放阅读框含有495个碱基，可编码164个氨基酸。IFN-γ可诱导病毒感染的细胞表达病毒抗原，增加免疫系统识别和杀伤感染细胞的能力，还可作为免疫佐剂参与机体的免疫反应。目前，关于鸭重组干扰素的研究仍局限于对单个干扰素的表达及活性研究，尚无将两个鸭干扰素基因串联表达并检测其抗病毒活性的例子。禽流感(Avianinfluenza,AI)是由流感病毒(Avianinfluenzavirus)引起的急性高度接触性传染病，临床表现为严重的发病和死亡，或轻度呼吸道感染，或无症状。1878年首次在意大利发现，目前，几乎已遍布世界各地，给养殖业造成了严重的经济损失。流感在家禽中以鸡和火鸡的易感性最高，鸭、鹅和鹌鹑等动物也能感染，1956年英国科学家首次证明甲型流感病毒能够感染鸭。近年来，在我国部分省份不断出现鸭感染流感病毒的现象，严重阻碍养鸭业的健康发展。鸭瘟(Duckplague,DP)是鸭的一种急性败血性传染病，临床特征主要为体温升高，下痢，两脚发软无力，部分发病鸭表现为头颈部肿大。该病传播迅速，发病率高，鸭群感染鸭瘟病毒后，往往引起大批量死亡。鸭瘟主要通过疫苗预防，若出现发病，可用聚肌胞(简称PolyI:C,属A级干扰素诱生剂)肌肉注射，效果显著。
技术实现思路
为克服上述现有技术中存在的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供一种串联鸭α、γ干扰素基因。本专利技术所述的串联鸭α、γ干扰素基因易于生产，成本低，活性高，具有叠加的鸭IFN-α、IFN-γ抗病毒功能，对流感和鸭瘟均有很好的治疗效果。本专利技术的另一目的在于提供上述串联鸭α、γ干扰素基因的制备方法。本专利技术的另一目的在于提供上述表达串联鸭α、γ干扰素基因的原核表达质粒pET32a-IFNα-linker-IFNγ。本专利技术的另一目的在于提供上述原核表达质粒pET32a-IFNα-linker-IFNγ的制备方法。本专利技术的再一目的在于提供上述串联鸭α、γ干扰素基因的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种串联鸭α、γ干扰素基因(IFNα-linker-IFNγ)，其核苷酸序列如下：Ttctcctgcagccccctgcgcctccacgacagcgccttcgcctgggacagcctccagctcctccgcaacatggctcccagccccacacagccctgcccgcagcaacacgcgccttgctccttcccggacaccctcctggacaccaacgacacgcagcaagccgcacacaccgccctccacctcctccaacacctcttcgacaccctcagcagccccagcacccccgcgcactggctccacaccgcacgccacgacctcctcaaccagcttcagcaccacatccaccacctcgagcgctgcttcccagccgacgccgcgcgcctccacaggcgagggccccgcaaccttcacctcagcatcaacaagtacttcggctgcatccaacacttcctccagaaccacacctacagcccctgcgcatgggaccacgtccgcctcgaggctcacgcctgcttccagcgcatccaccgcctcacccgcaccatgcgcggtggaggaggctctggtggaggcggtagcggaggcggagggtcgatgacttgccagacctactgcttgtttgttctctctgtcatcatgatttattttggatgttctggaagtgctttatttctaggtcaacttcaaaatgacatagacaaactgaaagctgattttaatgcaagtaattcggatgtagctgatggcaatcctgtttttatagagaaagtgaaaaactggacagagagaaatgaaaaaaggatcatactgagccagattgttaccctgtacttggaaatgctaaagaaaactgacatgtcaaagccacacatcaaaaatttatctgagcagctcaatactctgagaaataccctttccaatgactacaagaagttcagagacctcgtggaactgtcaaaccttcagctgactggcttgaaaatccaacgcaaggctgtgagtgagctgttcagtgtcttacagaaactggtggagacttcgacttccaaaaggaaaaggagccagtctccaaagagatgcagatgttaa。所述的串联鸭α、γ干扰素基因是应用重叠延伸PCR(genesplicingbyoverlapextension，SOE-PCR)方法，将去除信号肽的鸭α、γ干扰素基因通过一疏水性柔性氨基酸接头(linker)(G4S)3连接，然后将串联好的鸭IFNα-linker-IFNγ基因克隆至原核表达载体pET32a(+)上，构建成重组表达载体pET32a-IFNα-linker-IFNγ，通过BL21系统进行表达，鉴定纯化后，分别在体内和体外检测其抗流感和鸭瘟活性。上述的串联鸭α、γ干扰素基因的制备方法，具体包括以下步骤：(1)引物的设计与合成根据Genbank中提供的鸭IFN-α和IFN-γ序列，分别设计2对引物IFNα-F1、IFNα-R1和IFNγ-F1、IFNγ-R1，用于扩增去除信号肽后的鸭IFN-α基因(核本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种串联鸭α、γ干扰素基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种串联鸭α、γ干扰素基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO：
1所示。
2.权利要求1所述的串联鸭α、γ干扰素基因的制备方法，其特征在于：具
体包括以下步骤：
(1)引物的设计与合成
根据Genbank中提供的鸭IFN-α和IFN-γ序列，分别设计2对引物IFNα-F1、
IFNα-R1和IFNγ-F1、IFNγ-R1，用于扩增去除信号肽后的鸭IFN-α基因和IFN-γ
基因，并分别在IFN-α上游和IFN-γ下游加入BamHI和HindIII两个酶切位点；
同时，设计用于SOE-PCR的引物IFNα-R2和IFNγ-F2，其中，IFNα-R2中含有
部分linker序列，IFNγ-F2中含有与IFNα-R2互补的linker序列；引物序列如下：
去除信号肽后IFNα的扩增引物：
IFNα-F1的序列如SEQIDNO：4所示；
IFNα-R1的序列如SEQIDNO：5所示；
IFNα-R2的序列如SEQIDNO：6所示；
去除信号肽后IFNγ的扩增引物：
IFNγ-F1的序列如SEQIDNO：7所示；
IFNγ-F2的序列如SEQIDNO：8所示；
IFNγ-R1的序列如SEQIDNO：9所示；
(2)鸭α、γ干扰素基因的扩增
从鸭外周血淋巴细胞中抽提RNA，经反转录后，得到扩增鸭α、γ干扰素基
因的cDNA模板；以此cDNA为模板，分别用上述引物IFNα-F1、IFNα-R1和
IFNγ-F1、IFNγ-R1，扩增出所需鸭α、γ干扰素目的基因；
(3)SOE-PCR扩增串联鸭α、γ干扰素基因
该过程主要包含3个PCR反应，第一个PCR：以IFNα-F1和IFNα-R2为
引物扩增出含有部分linker序列的IFN-α，以IFNγ-F2和IFNγ-R1为引物扩增出
含有部分linker序列的IFN-γ，并分别进行胶回收；第二个PCR：以第一个PCR
扩增出的基...

【专利技术属性】
技术研发人员：任涛，高佩，黎玉莲，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44