野生型IDH2基因作为靶标在制备非小细胞肺癌治疗药物中的应用制造技术

本发明专利技术涉及野生型IDH2基因作为靶标在制备非小细胞肺癌治疗药物中的应用。IDH2在肺癌组织中表达上调，野生型IDH2促进肺癌细胞增殖和肺癌细胞裸鼠移植瘤生长，抑制细胞死亡。敲减野生型IDH2可以有效抑制细胞增殖和肺癌细胞裸鼠移植瘤生长，增加细胞死亡。IDH2过表达降低细胞内α‑酮戊二酸含量，采用添加α‑酮戊二酸的方式可以抑制非小细胞肺癌细胞的增殖，IDH2过表达也增加了细胞内的2‑羟基戊二酸的含量，可能抑制细胞死亡。本发明专利技术为临床肺癌的治疗提供了靶标基因IDH2，为相关药物靶点的研究提供了理论依据。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医学领域，具体涉及野生型IDH2基因作为靶标在制备非小细胞肺癌治疗药物中的应用。
技术介绍
随着经济社会的发展与疾病谱的改变，我国肺癌等肿瘤的发病率明显上升。根据中国肿瘤登记年报(2012)，我国全国肿瘤登记地区恶性肿瘤发病第一位的是肺癌。其发病率为53.57/10万，人口标化后为25.34/10万，五年生存率只有10％-15％。肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌。在我国，约80％的肺癌被诊断为非小细胞肺癌。异柠檬酸脱氢酶2(isocitrate dehydrogenase 2,IDH2)是细胞代谢途径中参与三羧酸循环的酶，位于染色体15q26.1，亚细胞定位于线粒体基质。其生理功能是正向催化异柠檬酸氧化产生α-酮戊二酸，同时还原NADP+产生NADPH。其逆向反应催化α-酮戊二酸产生异柠檬酸，并消耗NADPH产生NADP+。近来，在WHO二期和三期胶质瘤中发现大于70％的IDH1/2突变，IDH1R132和IDH2R140/172突变位点也在其它肿瘤中被发现，如急性粒细胞白血病、甲状腺癌、软骨肉瘤、肝内胆管细胞癌、前列腺癌、急性B淋巴细胞白血病、副神经节瘤、结直肠癌和黑色素瘤等肿瘤。IDH1/2突变后获得了新的功能，即催化a-酮戊二酸产生致癌代谢物2羟基戊二酸(2-HG)。IDH1/2突变一方面消耗a-酮戊二酸，另一方面产生2羟基戊二酸，最终抑制以a-酮戊二酸为底物反应的一系列脱双氧酶的活性，从而增强细胞代谢，抑制细胞胶原蛋白形成和细胞分化。目前，突变型IDH2靶向药物已进入I期临床实验阶段，IDH2口服选择性抑制剂AG-221在扩展I期研究发现，158名晚期血液肿瘤患者中63名病情缓解(40％)，76％的患者疗效持续超过6个月，部分患者超过15个月。野生型IDH2的序列已公开，genebank编号为NG_023302.1。研究表明野生型IDH2也在肿瘤细胞增殖和死亡中具有重要功能。IDH2基因敲除小鼠体内的黑色素瘤细胞移植瘤形成受到明显抑制，肿瘤血管生成标志物明显减少。IDH2逆向反应可以在低氧条件通过谷氨酰胺代谢经过a-酮戊二酸产生柠檬酸，从而促进胶质瘤细胞增殖和增加细胞活力。乳腺癌细胞Myc基因驱动逆向IDH1/2反应产生2羟基戊二酸，抑制细胞凋亡。目前野生型和突变型IDH2在肺癌中的研究尚未有文献报道。
技术实现思路
本专利技术的专利技术人研究表明IDH2信使RNA在肺癌组织中高表达，提示IDH2可能是肺癌的治疗靶标。专利技术人在非小细胞肺癌细胞H460和A549过表达及敲减IDH2，使用MTS、细胞计数和流式细胞术手段检测IDH2对于非小细胞肺癌细胞生长、增殖和死亡等生物学行为的影响。进一步接种免疫缺陷小鼠，观察IDH2对裸鼠移植瘤生长的作用。发现IDH2能够促进肺癌细胞增殖和肺癌细胞裸鼠移植瘤生长，抑制细胞死亡。敲减IDH2可以有效抑制细胞增殖和肺癌细胞裸鼠移植瘤生长，增加细胞死亡。IDH2过表达降低细胞内α-酮戊二酸(α-KG)含量，采用添加α-酮戊二酸的方式可以抑制非小细胞肺癌细胞的增殖，IDH2过表达也增加了细胞内的2-羟基戊二酸的含量，可能抑制细胞死亡。即，本专利技术提出野生型IDH2可作为非小细胞肺癌的潜在治疗靶标。野生型IDH2基因可作为靶标用于制备非小细胞肺癌治疗药物、用于制备抑制非小细胞肺癌细胞增殖的药物、用于制备诱导非小细胞肺癌细胞死亡的药物。IDH2在肺癌组织中表达上调，野生型IDH2促进肺癌细胞增殖和肺癌细胞裸鼠移植瘤生长，抑制细胞死亡。敲减野生型IDH2可以有效抑制细胞增殖和肺癌细胞裸鼠移植瘤生长，增加细胞死亡。IDH2过表达降低细胞内α-酮戊二酸含量，采用添加α-酮戊二酸的方式可以抑制非小细胞肺癌细胞的增殖，IDH2过表达也增加了细胞内的2-羟基戊二酸的含量，可能抑制细胞死亡。本专利技术为临床肺癌的治疗提供了靶标基因IDH2，为相关药物靶点的研究提供了理论依据。附图说明图1为实施例1实验结果图：图1显示了IDH2在肺癌组织与癌旁组织中的信使RNA表达；图2、3、4、5为实施例2实验结果图：图2a显示了H460及A549细胞IDH2热点突变序列测序与NCBI数据库的比对结果；图2b显示了IDH2过表达细胞IDH2蛋白含量的western检测结果，图2c显示了IDH2敲减细胞IDH2蛋白含量的western检测结果；图3a显示了IDH2过表达细胞增殖活性的检测结果；图3b显示了IDH2敲减细胞增殖活性的检测结果；图4a显示了IDH2过表达细胞增殖数目的检测结果；图4b显示了IDH2敲减细胞增殖数目的检测结果；图4c显示了IDH2过表达细胞α-酮戊二酸含量；图4d显示了IDH2敲减细胞α-酮戊二酸含量；如图4e显示了在过表达IDH2的肺癌细胞H460-IDH2和A549-IDH2的细胞培养过程中添加α-酮戊二酸，抑制了细胞的增殖；图5a显示了IDH2过表达细胞死亡比例的检测结果；图5b显示了IDH2敲减细胞死亡比 例的检测结果；图5c显示了IDH2过表达的肺癌细胞的2-HG含量；图6为实施例3实验结果图：图6a显示了IDH2过表达后，肺癌细胞裸鼠移植瘤体积的变化；图6b显示了IDH2过表达后，肺癌细胞裸鼠移植瘤重量的变化；图6c显示了IDH2敲减后，肺癌细胞裸鼠移植瘤体积的变化；图6d显示了IDH2敲减后，肺癌细胞裸鼠移植瘤重量的变化。具体实施方式实施例1.IDH2信使RNA表达在肺癌组织中增加目前多个数据库包含大量肿瘤临床样本数据，如美国癌症“登月计划”近期已公布1.2万名癌症患者的原始数据，供研究者分析。为分析IDH2在肺癌组织与癌旁组织的表达差异，申请人调取临床样本数据库中IDH2肺癌组织与癌旁组织的信使RNA表达，进行分析统计。实验方法：通过查询oncomine数据库中IDH2表达数据。采用t-test函数分析表达数据，绘制IDH2表达差异数据，并进行统计学分析。实验结果：IDH2在数据库多个芯片数据中在肺癌组织中相对癌旁组织均高表达，没有低表达的样本。其中样本数目最多的实验组如图1所示，IDH2在肺癌组织中高表达，且具有统计学差异(P＝2.8E-13)。实施例2.IDH2促进非小细胞肺癌细胞增殖，抑制细胞死亡。本部分以非小细胞肺癌细胞H460和A549为母细胞，以慢病毒导入的方式构建了H460和A549过表达及敲减野生型IDH2的细胞模型。检测IDH2过表达及敲减后非小细胞肺癌细胞增殖和死亡的改变。1.H460和A549过表达及敲减野生型IDH2的细胞模型构建我们首先对H460和A549细胞的IDH2热点突变区域进行测序，确认细胞模型中IDH2为野生型。为研究IDH2对细胞增殖与死亡的作用，采用慢病毒导入的方式构建了H460和A549过表达及敲减野生型IDH2的细胞模型。实验方法：H460和A549细胞细胞经过RNA提取及逆转录制备cDNA后，PCR扩增IDH2热点区域序列，送华大基因进行测序，最后与NCBI数据库中野生型IDH2序列进行比对。过表达、敲减细胞的母细胞复苏，培养后，将待感染的细胞接种于培养皿后，待细胞生长至80％-90％的融合度时弃培基。慢病毒溶液按1:3与新鲜培养基混合后加入培养皿中，同时加入终浓度为1ug/ml的pol本文档来自技高网...

【技术保护点】
野生型IDH2基因作为靶标在制备非小细胞肺癌治疗药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.野生型IDH2基因作为靶标在制备非小细胞肺癌治疗药物中的应用。2.野生型IDH2基因作为靶标在制备抑制非...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹亚，李江江，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43