Methods to evaluate the 2 cells on the biological safety of nano Caco based on Zinc Oxide 3D, belongs to the detection of microorganism or test method comprises the following steps: 1) 3D cells; 2) cells; 3) nano Zinc Oxide powder is dispersed in a serum-free culture medium of DMEM 4) in 3D culture reserve; under the condition of nano materials characterization and cell morphology, cell viability by MTT assay, the inflammatory cytokines interleukin 8 (IL 8) were detected by cell flow cytometry to detect different death; analysis was performed using SPSS19.0 statistical software, analysis, calculation of p< single factor the variance of data; 0.05 and p< 0.01 significant differences. The present invention evaluates the biological effect of nano Zinc Oxide on 3D cell culture model and its toxicity to nano Zinc Oxide. These studies have some theoretical significance for the in vitro study on the intestinal toxicity of nano Zinc Oxide, and provide reference for the formulation of the limited standard of Zinc Oxide.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物的测定或检验方法
,具体涉及为基于3D的Caco-2细胞对纳米氧化锌生物安全性的评价方法。
技术介绍
目前,纳米材料对环境和人类健康影响的研究还不完善,相关的信息比较少。与常规食品材料相比,纳米食品材料粒径较小,与其在理化性质上的差异较大,并且纳米材料在机体内的生物活性,以及产生的生物正副效应均得到放大,诱导的细胞毒性也可能会增强。因此,需要大量科学的毒理学权威信息,解释什么剂量范围内是危险的,什么剂量范围内是安全的。在众多的金属纳米材料中,纳米氧化锌是被广泛应用的材料之一。纳米氧化锌是一种粒径在 1~100nm 的新型高功能精细无机材料。与常规氧化锌相比,纳米氧化锌具有极强的抗氧化性、抗腐蚀性、光催化性和独特的抗紫外线性,使其在光电学、橡胶工业、涂料陶瓷、化妆品、食品添加剂、生物医学等方面应用广泛,而且在光、声、电纳米器件等领域将有着广阔的应用前景。目前已知纳米氧化锌可通过皮肤接触、呼吸道、消化道和静脉注射等途径进入机体,但机体很难排除这类微小物质,因此潜在一定的毒性效应。物质被纳米化后,其毒性、吸收和排泄方式都有所改变。纳米氧化锌的细胞毒理学研究开展较为广泛,已证明纳米氧化锌对人肺腺癌细胞、人结肠癌细胞、人胚肺成纤维细胞和呼吸道上皮细胞等多种细胞系有毒性作用。细胞是大多数生物体的基本单位,其变化大体上可反映生物机体功能与结构的变化,而当机体功能与结构未发生变化时,细胞功能与结构也可能发生改变。细胞毒理学主要是应用体外细胞技术手段研究环境中物理、化学和生物等多种污染物对细胞的损伤效应与规律,从而获得该物质的细胞毒效应、与剂量有 ...
【技术保护点】
基于3D的Caco‑2细胞对纳米氧化锌生物安全性的评价方法,其特征在于,包括如下步骤:1)3D细胞培养:在试验前将无菌离心管分装的Matrigel胶置于冰上溶解2~3 h,再将移液器枪头和96孔培养板置于冰上冷却1 h;取10~20 μL Matrigel胶均匀的包埋细胞培养板底部,置于37 ℃细胞培养箱30 min使其凝固;消化二维细胞,计数并稀释至2 x 104/mL,分别吸取50 μL细胞悬液和Matrigel胶,按1:1混匀后转入96孔培养板,再置于37 ℃细胞培养箱30 min使其凝固;重新凝固的胶上层滴加100 μL 含有10% FBS和1% L‑谷氨酰胺的完全DMEM培养基,在条件为37 ℃、5% CO2的培养箱中静置培养,每隔2~3天换一次完全DMEM培养基;2)细胞传代:Caco‑2细胞贴壁生长,经过3‑4 d,细胞生长至单层80%‑95%时,弃掉上清液,用适量PBS轻轻冲洗,弃掉废液,加入0.25%胰蛋白酶进行消化3‑5 min,在倒置显微镜下观察到细胞刚刚变圆时,加入少量10%胎牛血清的DMEM培养基终止细胞消化过程,用吸管吸取培养基,轻轻吹打使细胞不再贴壁,将细 ...
【技术特征摘要】
1.基于3D的Caco-2细胞对纳米氧化锌生物安全性的评价方法,其特征在于,包括如下步骤:1)3D细胞培养:在试验前将无菌离心管分装的Matrigel胶置于冰上溶解2~3 h,再将移液器枪头和96孔培养板置于冰上冷却1 h;取10~20 μL Matrigel胶均匀的包埋细胞培养板底部,置于37 ℃细胞培养箱30 min使其凝固;消化二维细胞,计数并稀释至2 x 104/mL,分别吸取50 μL细胞悬液和Matrigel胶,按1:1混匀后转入96孔培养板,再置于37 ℃细胞培养箱30 min使其凝固;重新凝固的胶上层滴加100 μL 含有10% FBS和1% L-谷氨酰胺的完全DMEM培养基,在条件为37 ℃、5% CO2的培养箱中静置培养,每隔2~3天换一次完全DMEM培养基;2)细胞传代:Caco-2细胞贴壁生长,经过3-4 d,细胞生长至单层80%-95%时,弃掉上清液,用适量PBS轻轻冲洗,弃掉废液,加入0.25%胰蛋白酶进行消化3-5 min,在倒置显微镜下观察到细胞刚刚变圆时,加入少量10%胎牛血清的DMEM培养基终止细胞消化过程,用吸管吸取培养基,轻轻吹打使细胞不再贴壁,将细胞悬液转移到新的培养瓶中,并加入适量培养基,放入条件为37 ℃、5% CO2的培养箱中培养3-4 d后,进行下一次传代培养;3)将纳米氧化锌粉末分散在无血清的DMEM培养基中,制成不同浓度纳米氧化锌悬液;放入4 ℃冰箱中备用;每次使用前,需使用使用超声波细胞破碎仪使纳米材料解聚,超声条件为:3 min,超3 s停2 s,功率300 w;4)在3D培养条件下,进行纳米材料表征和细胞形态学观察,采用MTT比色法检测细胞活性,对炎症因子白细胞介素-8(IL-8)进行检测,借助流式细胞仪检测不同的细胞死亡方式;使用 SPSS19.0统计软件进行分析,对数据进行单因素方差分析,计算p<0.05和p<0.01的差异显著性。2.如权利要求1所述的基于3D的Caco-2细胞对纳米氧化锌生物安全性的评价方法,其特征在于,步骤4)中,所述纳米材料表征,包括以下步骤:纳米颗粒由无水乙醇超声混悬,滴加到铜网上干燥透射电镜下镜检;采用马尔文粒径仪对纳米颗粒进行强度和粒径分布的分析。3.如权利要求1所述的基于3D的Caco-2细胞对纳米氧化锌生物安全性的评价方法,其特征在于,步骤4)中,所述细胞形态学观察,包括以下步骤:将3D 培养条件下的Caco-2细胞,进行染毒处理,细胞分别与浓度为10和75 μg/mL的24 nm纳米氧化锌染毒溶液共培养12 h;孵育12 h后,在倒置显微镜下观察细胞形态,并拍摄照片;对照组细胞是与无血清的DMEM培养基共培养。4.如权利要求1所述的基于3D的Caco-2细胞对纳米氧化锌生物...
【专利技术属性】
技术研发人员:关荣发,陶淼,梁提松,俞晓平,王彦波,刘明启,
申请(专利权)人:中国计量大学,
类型:发明
国别省市:浙江;33
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