用标记基因预测外源基因表达量及筛选转基因家蚕的方法技术

本发明专利技术公开了一种用标记基因预测外源基因表达量及筛选转基因生物的方法。采用分子生物学技术构建包含有标记基因和外源基因两个相邻且转录方向相同的表达框的转基因表达质粒；采用显微注射法将转基因质粒与辅助质粒一起导入到生物的基因组内，培育成外源基因能够稳定遗传和表达的转基因生物；根据转基因生物中标记基因表达量的信息预测外源基因表达量，并筛选获得该外源基因表达量对应的生物个体或品种。本发明专利技术可简单、快捷、省力地从大量的转基因生物中筛选出高效表达外源基因的转基因生物个体或品种，为建立高效的生物反应器提供了理想的筛选手段。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及转基因生物领域中的一种预测及筛选的方法，尤其是涉及一种用标记基因预测外源基因表达量及筛选转基因生物的方法。
技术介绍
利用分子生物学技术将外源基因插入到生物体基因组内，使外源基因能够稳定遗传和表达，这种技术称为转基因技术，对应的生物称为转基因生物。如果外源基因的表达产物是蛋白质，而且是在一个封闭的系统，如乳腺、膀胱、丝腺等系统中表达，这种转基因生物称为生物反应器。在大多数的转基因研究中，外源基因一般都是随机的插入到宿主基因组中，分布在基因间隔区、基因内含子、基因外显子等区域。不同插入位点的外源基因其表达量会有差异，这种现象被称为位置效应。因此，要想筛选、获得外源基因大量表达的转基因生物，就必须对大量的转基因个体进行qRT-PCR、Western等分子生物学鉴定，以确定优秀个体，筛选的工作量大，耗时长，这已成了开发和利用转基因生物的制约环节。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用标记基因预测外源基因表达量及筛选转基因生物的方法，利用两个紧密相邻的、表达框同向的外源基因表达量具有显著相关性的特点，根据标记基因表达量预测外源基因表达量并进一步筛选转基因生物，简单有效，这可以快速地从大量的转基因个体中筛选出高效表达外源基因的转基因个体或品种，为加快构建高效的生物反应器奠定基础。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案的步骤如下：1）采用分子生物学技术构建包含有标记基因和外源基因两个表达框的转基因表达质粒，标记基因和外源基因两个表达框的相邻间隔小于30bp且转录方向相同；2）采用显微注射法将步骤1）得到的转基因质粒与为转基因质粒中转座子提供转座酶的辅助质粒一起导入到生物的基因组内，培育成外源基因能够稳定遗传和表达的转基因生物；3）得到的转基因生物中的标记基因表达量和外源基因表达量具有显著相关性，根据转基因生物中标记基因表达量的信息进行预测和筛选，预测外源基因表达量，并筛选获得该外源基因表达量对应的生物个体或品种。优选地，所述的转基因表达质粒中标记基因和外源基因两个表达框的前后次序任意。优选地，所述的标记基因采用EGFP标记基因。优选地，所述的外源基因采用萤火虫荧光素酶基因（Fluc）或海肾荧光素酶 (Rluc)基因。优选地，所述的宿主采用家蚕。优选地，所述的转基因质粒与辅助质粒的混合比例为1:0.5~1:1。本专利技术具有的有益效果是：本专利技术利用两个紧密相邻的、表达框同向的外源基因表达量具有显著相关性的特点，可用标记基因的表达水平来预测与之相邻的外源基因表达水平。这种方法相比传统的转基因生物外源基因表达水平检测，具有简便、省时、省钱的优势。因为标记基因的检测手法多，技术成熟，所以它可以快速、高效的从大量的转基因个体中筛选出高效表达外源基因的转基因生物，提高转基因生物筛选效率，为建立高效的生物反应器提供了理想的筛选手段。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。本专利技术的实施例如下：实施例1：本实施例构建了一个外源基因在前、标记基因在后，且以piggyBac转座子为基础的转基因质粒pBSer1Fluc-A3EGFP，转基因质粒中，由家蚕中部丝腺特异性表达的胶蛋白1基因（Ser1）启动子启动萤火虫荧光素酶（Fluc）外源基因的表达框，由肌动蛋白A3启动子启动绿色荧光蛋白（EGFP）标记基因的表达框，其中家蚕中部丝腺特异性表达的丝胶蛋白1基因（Ser1）启动子截取了575bp长度的近端启动子，萤火虫荧光素酶（Fluc）外源基因表达框和绿色荧光蛋白（EGFP）标记基因表达框的相邻间隔为25bp。将pBSer1Fluc-A3EGFP转基因质粒与为piggyBac转座子提供转座酶的辅助质粒一起溶解在pH7.6磷酸缓冲液中，磷酸缓冲液中pBSer1Fluc-A3EGFP质粒和辅助质粒按1:0.5比率混合，两种质粒的注射总浓度为0.4μg/μl。然后采用显微注射法将混合质粒导入家蚕产卵后8小时内的受精卵内，注射总体积为10nl左右。注射后的蚕卵在25℃温度、85%湿度、12h光照的条件下饲养至成虫，自交得到G1代。在G1代小蚕期，利用日本Olympus SZX12荧光显微镜，筛选出表达EGFP标记基因的阳性家蚕，荧光显微镜的激发波长为460nm～490nm，发射波长为510 nm～550 nm。G1代转基因家蚕饲养至五龄第三天时，共取7个转基因家蚕蛾区，由于piggyBac转座子插入基因组的随机性，7个转基因家蚕蛾区被鉴定证明具有不同插入位点，每个蛾区取3条蚕的中部丝腺作为3个生物学重复。采用荧光定量PCR技术，以Rp49为内参基因检测2个顺序排列表达框中的外源基因Fluc和标记基因EGFP的转录水平，相关性统计分析结果表明7个转基因家蚕品种的Fluc和EGFP转录水平的相关关系达到极显著水平，具体结果为：决定系数R2=0.8382，相关系数r=0.9155，概率值P＜0.01。该数据证明转基因生物中2个紧密相邻的、表达框同向的外源基因表达量具有显著相关性，即使外源基因插入位点不同，因为标记基因和外源基因两个表达框紧密相邻，所以外源基因Fluc的转录水平依然与标记基因EGFP的转录水平存在极显著相关。实施例最后对转基因蚕根据EGFP荧光强弱进行检测，以此判断EGFP标志基因表达量，预测Fluc外源基因表达量，筛选获得了Fluc外源基因表达量对应的家蚕个体。实施例进一步对另一次相同的转基因实验的8个G2代转基因家系，根据EGFP荧光强弱进行检测，以此判断了EGFP标志基因表达量，预测了Fluc外源基因表达量。首先确定了标记基因EGFP转录水平最高的品种为ZY153，实验再用8个G2代转基因家系的其他个体，实际检测了Ｆluc标志基因表达水平，结果比较证明这个品种的外源基因Ｆluc的转录水平确是最高的，即使采用高水平表达的Rp49为内参基因，其相对转录水平仍达到3.3%。实施例证明可以利用标记基因EGFP表达量预测外源基因Ｆluc表达量，并进一步筛选得到外源基因Ｆluc表达量最高的转基因家蚕品种。虽然从mRNA到蛋白质有一个转录后修饰的过程，但因为同一基因的转录后修饰过程是一样的，所以对同一基因而言，选择了转录水平最高的品种，也就是选择了蛋白表达水平最高的品种。实施例2：本实施例构建了一个外源基因在前、标记基因在后，且以piggyBac转座子为基础的转基因质粒pBSer1Fluc-A3EGFP，转基因质粒中，由家蚕中部丝腺特异性表达的胶蛋白1基因（Ser1）启动子启动萤火虫荧光素酶（Fluc）外源基因的表达框，由肌动蛋白A3启动子启动绿色荧光蛋白（EGFP）标记基因的表达框，其中家蚕中部丝腺特异性表达的丝胶蛋白1基因（Ser1）启动子截取了4000bp长度的近端启动子，外源基因表达框和标记基因表达框的相邻间隔为25bp。将pBSer1Fluc-A3EGFP转基因质粒与为piggyBac转座子提供转座酶的辅助质粒一起溶解在pH7.6磷酸缓冲液中，磷酸缓冲液中pBSer本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用标记基因预测外源基因表达量及筛选转基因生物的方法，其特征在于该方法的步骤如下：1）采用分子生物学技术构建包含有标记基因和外源基因两个表达框的转基因表达质粒，标记基因和外源基因两个表达框的相邻间隔小于30bp且转录方向相同；2）采用显微注射法将步骤1）得到的转基因质粒与为转基因质粒中转座子提供转座酶的辅助质粒一起导入到生物的基因组内，培育成外源基因能够稳定遗传和表达的转基因生物；3）得到的转基因生物中的标记基因表达量和外源基因表达量具有显著相关性，根据转基因生物中标记基因表达量的信息进行预测和筛选，预测外源基因表达量，并筛选获得该外源基因表达量对应的生物个体或品种。

【技术特征摘要】
1. 一种用标记基因预测外源基因表达量及筛选转基因生物的方法，其特征在于该方法的步骤如下：
1）采用分子生物学技术构建包含有标记基因和外源基因两个表达框的转基因表达质粒，标记基因和外源基因两个表达框的相邻间隔小于30bp且转录方向相同；
2）采用显微注射法将步骤1）得到的转基因质粒与为转基因质粒中转座子提供转座酶的辅助质粒一起导入到生物的基因组内，培育成外源基因能够稳定遗传和表达的转基因生物；
3）得到的转基因生物中的标记基因表达量和外源基因表达量具有显著相关性，根据转基因生物中标记基因表达量的信息进行预测和筛选，预测外源基因表达量，并筛选获得该外源基因表达量对应的生物个体或品种。
2. 根据权利要求1所述的一种用标记基因预测外源基因表达量及筛选转...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟伯雄，叶露鹏，钱秋杰，张玉玉，尤征英，王少华，车佳倩，宋佳，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33