本发明专利技术公开了一种用于过量表达猪PBD-2基因的转基因猪的培育方法，其步骤：①pcDNA3.1(+)/pCA-PBD2载体构建与线性化：设计引物，提取猪的肝脏组织RNA，进行RT-PCR扩增获得PBD-2基因，乙醇沉淀，用灭菌水溶解；②脂质体转染及细胞筛选：构建过量表达PBD-2的猪成纤维细胞；③手工克隆方法获取重组囊胚；④胚胎移植：将培育好的囊胚移入代孕母猪的输卵管中；⑤转基因猪的鉴定。方法易行，操作简便。克隆猪PBD-2基因后，将其插入到表达载体中通过细胞转染筛选出过表达猪PBD-2的猪成纤维细胞；过表达PBD-2的猪成纤维细胞进行手工核移植于猪卵母细胞而获得重构囊胚，将阳性囊胚移植入受体母猪输卵管中，获得过表达PBD-2基因的转基因猪。具有潜在广泛抗菌能力，为抗病育种研究提供良好素材。
【技术实现步骤摘要】
一种过量表达PBD-2基因的转基因猪的培育方法
本专利技术涉及生物医药技术和抗病育种领域。具体涉及一种具有抵抗动物细菌性疾病的转基因猪的培育方法，通过手工体细胞核移植技术制备过量表达猪源β防御素 2(porcie beta-defensin 2, PBD-2)基因的转基因猪。
技术介绍
抗菌药物在人类和动物疾病的临床治疗中起重要作用，但是由于抗菌药物的广泛和不合理应用，导致病原菌对人类和动物使用的各种抗菌药物日益耐受，出现了非常严峻的细菌耐药局面，以致于有些细菌性疾病几乎无有效药物可以控制。细菌耐药性的产生，引起了全世界各界的广泛关注，被世界卫生组织认为是21世纪最大的公共卫生安全问题之ο据估计，近年来动物使用抗生素的量是全球抗生素使用总量的一半以上，许多人认为动物食品中的耐药菌是人体内耐药菌的来源之一(Jensen LB, Hammerum AM, Bager F， Aarestrup FM Streptogramin resistance among Enterococcus faecium isolated from production animals in Denmark in 1997.)，在动物食品中细菌耐药性问题已成为公共卫生高度关注的问题。因此，新型的抗病方法，加快抗病育种研究具有重要而现实意义。抗病育种是一项复杂的系统工程，从遗传素质上来提高动物对病原的抗性，并结合免疫接种来控制动物的疾病。但是常规抗病育种技术对抗病等复杂性状的分析较困难、 选择效率较低、育种周期较长，已不能满足当前养殖业对抗病品种的需求。随着胚胎学、 分子生物学和基因工程技术的不断进步，从上个世纪80年代开始，人们就开始尝试进行基因工程抗病育种，并成为了生命科学研究和讨论的热点。随着1974年Jaenish等首先利用显微注射法将猿猴病毒(SV40)的DNA注入小鼠胚泡获得40%整合外源基因的子鼠后，1980年Gordon报道用DNA显微注射法获得了转基因小鼠(Gordon Jff, Scangos GA, Plotkin DJ, Barbosa JA, Ruddle FH :Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc Natl Acad Sci U S A 1980,77(12) :7380-7384)； 1982年，美国科学家I^lmiter首次将大鼠生长激素基因导入小鼠受精卵的雄性原核中，获得了转基因小鼠，其个体比对照鼠增大一倍，被称为“超级鼠”(Palmiter RD,Brinster RL, Hammer RE, Trumbauer ME, Rosenfeld MG, Birnberg NC, Evans RM Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected with metallothionein-growth hormone fusion genes. Nature 1982,300(5893) :611-615) ； 1994 年 Clements 等将 Visna 病毒的衣壳当百基因转入绵羊，获得了抗病能力明显提高的转基因羊(Clements JE，Wall RJ, Narayan 0, Hauer D, Schoborg R, Sheffer D, Powell A, Carruth LM, Zink MC, Rexroad CE :Development of transgenic sheep that express the visna virus envelope gene. Virology 1994,200(2) :370-380) ；2005年Donovan等将编码溶葡球菌酶的基因转入奶牛基因组中，获得的转基因牛对牛葡萄球菌感染率仅为14%，仅为非转基因牛高达71% (Donovan DM，Kerr DE, Wall RJ-Engineering disease resistant cattle. TransgenicRes 2005，14(5) :563-567)。防御素是广泛分布于动物和植物界的一类富含半光氨酸的阳离子短肽，是机体自身防御系统的组成部分。哺乳动物的防御素主要由骨髓细胞或上皮细胞产生，有分子质量小、热稳定、水溶性好等特点，其抗菌谱十分广泛。并且由于抗菌机制特殊，细菌极难产生耐药性，是近年来一直是代替抗菌药物的首选。猪源β防御素2 (porcie beta-defensin 2，PBD-2)是一种主要分布于猪上皮细胞中的一种阳离子多肽，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有很好的杀伤作用(Veldhuizen EJA, Rijnders M, Claassen EA, van Dijk A, Haagsman HP :Porcine β -defensin 2 displays broad antimicrobial activity against pathogenic intestinal bacteria. Molecular Immunology 2008,45(2) :386-394 ; Sang Y, Blecha F: Porcine host defense peptides :Expanding repertoire and functions. Developmental & Comparative Immunology 2009,33(3) :334-343)本专利技术以猪PBD-2为研究对象，基于传统克隆技术，利用真核质粒pcDNA3. 1(+)/ PCA-PBD2的构建转染大白猪成纤维细胞，通过G418筛选，PCR与RT-PCR鉴定建立转基因 PBD-2细胞系。将所建立的转基因细胞系用于手工核移植，借助囊胚移植4头受体母猪，有 3头母猪受孕，通过mRNA等检测PBD-2基因表达证实获得过表达PBD-2的转基因克隆猪。 该转基因猪可用于研究PBD-2抗病的动物模型以及培育具有抗病性能的优良品种猪。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了一种用于表达猪PBD-2基因的转基因猪的培育方法， 方法易行，操作简便。克隆猪PBD-2基因后，将其插入到表达载体中通过细胞转染及细胞筛选技术筛选出过表达猪PBD-2的猪成纤维细胞；过表达PBD-2的猪成纤维细胞进行手工核移植于猪卵母细胞而获得重构囊胚，进而将阳性囊胚移植入受体母猪输卵管中，受孕母猪产仔后再进行阳性转基因猪鉴定，从而获得过表达PBD-2基因的转基因猪。该猪具有潜在广泛抗菌能力，为抗病育种研究提供良好素材。为了实现上述的目的，本专利技术采用以下技术措施一种用于表达猪PBD-2基因的转基因猪的培育方法，其步骤是1.稳定表达PBD-2基因的猪成纤维细胞系的构建1. lpcDNA3. 1 (+)/pCA_PBD2 载体构建与线性化参照 GenBank NM_214442. 1 基因序列，设计引物，提取猪肝脏组织RNA，反转录成eDNA后用设计的弓|物扩增获得PBD-2基因， 大小为216bp。通过EcoRI和BioI本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于过量表达猪PBD-2基因的转基因猪的培育方法，其步骤是①pcDNA3.1 (+)/pCA-PBD2载体构建与线性化设计一对引物，提取猪肝脏组织RNA， RT-PCR扩增获得PBD-2基因，通过EcoRI和B10I将获得的片段连接到真核表达载体pCA 中，获得载体PCA-PBD2，通过kpl和XhoI双酶切pCA_PBD2和pCDNA3. 1⑴，通过连接酶连接得到pcDNA3. 1 (+) /PCA-PBD2，载体质粒大提后用AccI进行线性化处理，分离纯化得到线性表达盒片段，大小4189bp;②脂质体转染及细胞筛选为了构建稳定过量表达PBD-2的猪成纤维细胞，按照脂质体Lipofectamine 2000说明书进行转染上述制备的猪成纤维细胞，5% C02，37°C培养；转染PBD-2基因后，将核供体细胞培养2-4天，利用600 μ g/ml G418连续筛选8天后， 获得抗性单克隆细胞并扩大培养，通过PCR和RT-PCR方法对获得细胞进行鉴定，得到过量表达PBD-2的转基因猪成纤维细胞，用于后续手工核移植制备重组囊胚；③手工核移植方法获取重组囊胚a.受体细胞的准备制备受体细胞，从屠宰场收集猪的卵巢放置入生理盐水的容器内运输至实验室，将卵巢表面的卵泡戳破，使卵泡内的卵母细胞和卵泡液一起流出，用预热至 38. 5°C的洗卵液2% ν/ν血清洗涤卵泡，在显微镜下挑选颗粒细胞层多且致密，胞质均勻的卵母细胞，收集卵泡液中所有的卵母细胞，所得卵母细胞以40-50个为一个孔，移至在5% CO2培养箱平衡6小时，内置400 μ L卵母细胞体外培养液TCM-199 (IX) 80% v/v,hCG 15IU/ mL，PMSG 10IU/mL，谷氨酰胺0....
【专利技术属性】
技术研发人员：周锐，杨希，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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