用于敲除链霉菌基因的载体及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了用于敲除链霉菌基因的载体及其构建方法与应用。该重组载体是将葡聚糖酶基因插入pKC1139的ClaⅠ位点得到的重组DNA。在实际应用中，可在该重组载体的多克隆位点插入用于敲除链霉菌目的基因的DNA片段后得到链霉菌目的基因敲除载体，将该链霉菌目的基因敲除载体导入待敲除所述目的基因的链霉菌后筛选硫链丝菌素抗性的转化子，对硫链丝菌素抗性的转化子再进行纤维素降解筛选，具体可将硫链丝菌素抗性的转化子接入纤维素筛选平板上再进行刚果红染色直接观察纤维素的降解情况即可获得同源双交换转化子。这样可以避免抗生素抗性假阳性引起的未完全敲除基因的现象。同时可以避免大量转化子PCR验证。可用于任何不产葡聚糖酶菌株的基因敲除双交换转化子的筛选中。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用于敲除链霉菌基因的载体及其构建方法与应用。
技术介绍
链霉菌(streptomyces)是一种具有分枝状菌丝体结构的好氧革兰氏阳性土壤细菌，属于原核生物界放线菌目链霉菌科，是土壤中主要的微生物类群之一。其G%+C%含量高达70% -80%，是迄今为止自然界中已知G% +C%含量最高的一类生物。链霉菌虽然属于原核生物，但是却有着非常复杂的细胞分化机制，是研究基因在时间、空间和程序上表达调控机制的良好材料，其次链霉菌具有丰富的次级代谢多样性，自然界中近70%的抗生素是由链霉菌及其近缘放线菌产生的，此外链霉菌还产生其他有用的次级代谢产物如抗肿瘤药物、免疫抑制剂、抗虫剂及其他一些胞外水解酶等，广泛应用于工业、农业及医药卫生和生命科学研究领域。因此，揭示链霉菌遗传、发育及代谢调控的研究倍受重视，但是目前对于链霉菌生代谢调控机制的研究还不清楚，随着近年来天蓝色链霉菌、阿维链霉菌和灰色链霉菌的测序的完成，更多的链霉菌基因组测序工作正在进行，因此对新基因及已知基因的功能进行遗传分析迫在酶切，而研究基因最重要的方法就是进行基因敲除。基因敲除就是通过染色体同源重组，置换或者中断某个基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
构建重组载体的方法，是将葡聚糖酶基因插入pKC1139的ClaⅠ位点，得到的重组DNA即为所述重组载体。

【技术特征摘要】
1.构建重组载体的方法,是将葡聚糖酶基因插入PKC1139的ClaI位点，得到的重组DNA即为所述重组载体。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述葡聚糖酶基因编码如下a)或b)的蛋白质:a)氨基酸序列如SEQID N0.1所示的蛋白质；b)将SEQID N0.1中的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有降解纤维素活性的由a)衍生的蛋白质。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述葡聚糖酶基因的编码序列如SEQID N0.2 的第 208-1707 位。4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述葡聚糖酶基因的核苷酸序列是SEQID N0.2 的第 9-1707 位。5.由权利要求1-4中任一所述方法构建的重组载体。6.含有权利要求5所述重组载体的重...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴慧玲，刘伟成，董丹，刘霆，卢彩鸽，张涛涛，张殿朋，田兆丰，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：