本发明专利技术公开了用于敲除链霉菌基因的载体及其构建方法与应用。该重组载体是将葡聚糖酶基因插入pKC1139的ClaⅠ位点得到的重组DNA。在实际应用中，可在该重组载体的多克隆位点插入用于敲除链霉菌目的基因的DNA片段后得到链霉菌目的基因敲除载体，将该链霉菌目的基因敲除载体导入待敲除所述目的基因的链霉菌后筛选硫链丝菌素抗性的转化子，对硫链丝菌素抗性的转化子再进行纤维素降解筛选，具体可将硫链丝菌素抗性的转化子接入纤维素筛选平板上再进行刚果红染色直接观察纤维素的降解情况即可获得同源双交换转化子。这样可以避免抗生素抗性假阳性引起的未完全敲除基因的现象。同时可以避免大量转化子PCR验证。可用于任何不产葡聚糖酶菌株的基因敲除双交换转化子的筛选中。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及用于敲除链霉菌基因的载体及其构建方法与应用。
技术介绍
链霉菌(streptomyces)是一种具有分枝状菌丝体结构的好氧革兰氏阳性土壤细菌，属于原核生物界放线菌目链霉菌科，是土壤中主要的微生物类群之一。其G%+C%含量高达70% -80%，是迄今为止自然界中已知G% +C%含量最高的一类生物。链霉菌虽然属于原核生物，但是却有着非常复杂的细胞分化机制，是研究基因在时间、空间和程序上表达调控机制的良好材料，其次链霉菌具有丰富的次级代谢多样性，自然界中近70%的抗生素是由链霉菌及其近缘放线菌产生的，此外链霉菌还产生其他有用的次级代谢产物如抗肿瘤药物、免疫抑制剂、抗虫剂及其他一些胞外水解酶等，广泛应用于工业、农业及医药卫生和生命科学研究领域。因此，揭示链霉菌遗传、发育及代谢调控的研究倍受重视，但是目前对于链霉菌生代谢调控机制的研究还不清楚，随着近年来天蓝色链霉菌、阿维链霉菌和灰色链霉菌的测序的完成，更多的链霉菌基因组测序工作正在进行，因此对新基因及已知基因的功能进行遗传分析迫在酶切，而研究基因最重要的方法就是进行基因敲除。基因敲除就是通过染色体同源重组，置换或者中断某个基因，然后观察其表型变化。但是这种基因敲除的方法直接依赖于某一属或种的链霉菌中有效的基因工程载体及其遗传转化体系的建立，以便使人们能够更方便的筛选得到基因敲除突变株进行基因功能的研究。目前关于链霉菌属的遗传转化体系，包括 基因敲除的遗传体系基本上已经建立，基本上都是将携带有目的基因上下游同源臂及抗性基因的质粒在大肠杆菌和链霉菌之间进行属间接合转移的方法，利用大肠杆菌ET12567辅助质粒pUZ8002中包含的tra基因和穿梭载体上携带来自RP4接合转移起始位点oriT所诱导的接合转移。其中双交换转化子的筛选基本上都是根据抗生素的抗性和敏感性，利用平板影印的技术接合PCR扩增、southern杂交等方法来进行筛选的。但是由于抗生素抗性与敏感性用于影印筛选的时候，存在很大程度的假阳性；而直接通过PCR扩增筛选又会消耗大量的人力、物力，由于链霉菌作为革兰氏阳性细菌，其细胞壁较厚，菌落PCR的稳定性很差，所以利用抗生素抗性及PCR扩增的方法菌不能提高双交换转化子的筛选效率。
技术实现思路
本专利技术所要解决的一个技术问题是提供以葡聚糖酶基因作为筛选标记基因的用于敲除链霉菌基因的载体及其构建方法。本专利技术所提供的用于敲除链霉菌基因的载体，名称为pKCG+1139，是将葡聚糖酶基因插入pKC1139的Cla I位点得到的重组DNA。其中，pKC1139的物理图谱如图1所示，PKC1139质粒属于链霉菌基因组破坏型质粒，可用于基因阻断试验，实现对基因功能的验证，并可通过阻断一些负调控序列提高某些链霉菌中抗生素的产量或产孢活性(沈凤英，李亚宁，刘力强，吴伟刚，刘大群.生防链霉菌Men-myco-93-63遗传转化体系的建立和优化.中国农学通报2009，25(13): 197-201)。上述葡聚糖酶基因具体可编码如下a)或b)的蛋白质:a)氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示的蛋白质；b)将SEQ ID N0.1中的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有降解纤维素活性的由a)衍生的蛋白质。其中，SEQ ID N0.1由499个氨基酸残基组成。所述葡聚糖酶基因的编码序列具体可如SEQ ID N0.2的第208-1707位所示。在本专利技术的一个实施例中，所述葡聚糖酶基因的核苷酸序列具体可为SEQ IDN0.2 的第 9-1707 位。其中，SEQ ID N0.2由1715个核苷酸组成，第1_8位为Cla I识别位点和保护碱基，第9-207位为红霉素启动子，第208-1707位葡聚糖酶基因的编码序列，第1708-1715为Cla I识别位点和保护碱基。构建上述用于敲除链霉菌基因的载体的方法也属于本专利技术的保护范围。含有上述用于敲除链霉菌基因的载体的重组微生物也属于本专利技术的保护范围。所述重组微生物具体可为细菌，酵母，藻和真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia),链霉菌属(Streptomyces)等。上述用于敲除链霉菌基 因的载体可用于敲除不产葡聚糖酶的链霉菌的基因。其中，所述不产葡聚糖酶的链霉菌可为利迪链霉菌、恰塔努加链霉菌、纳塔尔链霉菌、褐黄孢链霉菌等。在本专利技术的一个实施例中，所述利迪链霉菌(Streptomyces Iydicus)为利迪链霉菌(Sti^ptomyces lydicus)A02CGMCC N0.1654，所述敲除不产葡聚糖酶的链霉菌的基因为敲除纳他霉素合成正调控基因。本专利技术所要解决的又一个技术问题是提供链霉菌目的基因敲除载体。本专利技术所提供的链霉菌目的基因敲除载体，是在上述用于敲除链霉菌基因的载体的多克隆位点插入用于敲除链霉菌目的基因的DNA片段得到的重组DNA。其中，所述用于敲除链霉菌目的基因的DNA片段通过同源重组替代所述目的基因从而将链霉菌中的目的基因敲除。所述用于敲除链霉菌目的基因的DNA片段自上游至下游可依次为所述目的基因的上游同源臂、硫链丝菌素抗性基因(tsr)和所述目的基因的下游同源臂。所述链霉菌目的基因敲除载体包含硫链丝菌素抗性基因(tsr)和阿泊拉霉素抗性基因(apm)，因此并不影响载体构建过程中在大肠杆菌和链霉菌中抗性转化子的筛选。本专利技术所要解决的又一个技术问题是提供一种制备目的基因被敲除的链霉菌突变株的方法。本专利技术所提供的制备目的基因被敲除的链霉菌突变株的方法，包括如下步骤:将上述链霉菌目的基因敲除载体导入待敲除所述目的基因的链霉菌中，通过硫链丝菌素抗性筛选得到硫链丝菌素抗性的转化子，从所述硫链丝菌素抗性的转化子中筛选不降解纤维素的转化子，得到的不降解纤维素的转化子即为候选的目的基因被敲除的链霉菌突变株；上述方法中，所述降解纤维素体现为降解羧甲基纤维素钠。上述方法中，所述待敲除所述目的基因的链霉菌为不产葡聚糖酶的链霉菌，如利迪链霉菌、恰塔努加链霉菌、纳塔尔链霉菌、褐黄孢链霉菌等。在本专利技术的一个实施例中，所述利迪链霉菌(Streptomyces Iydicus)为利迪链霉菌(Sti^ptomyces lydicus)A02CGMCC N0.1654，所述目的基因为纳他霉素合成正调控基因slnM。所述用于敲除链霉菌目的基因的DNA片段的核苷酸序列是SEQ ID N0.5。所述纳他霉素合成正调控基因slnM的编码序列是SEQ ID N0.4，编码氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示的蛋白质。其中，SEQ ID N0.4由579个核苷酸组成，SEQ ID N0.3由192个氨基酸残基组成。SEQ ID N0.5由4144个核苷酸组成，第29-1221位为纳他霉素合成正调控基因slnM的上游同源臂，第1265-2911位为硫链丝菌素抗性基因(tsr)，第2956-4117位纳他霉素合成正调控基因slnM的下游同源臂。本专利技术的用于敲除链霉菌基因的载体pKCG+1139将来自解淀粉芽孢杆菌的葡聚糖酶基因置于链霉菌中常用的红霉素启动子下，包含基因敲除双负筛选标记阿泊拉霉素抗性基因和葡聚糖酶基因。pKCG+1139可以在大肠杆菌(如Escherichia coli BL21、E.coliDH5 a本文档来自技高网...
【技术保护点】
构建重组载体的方法，是将葡聚糖酶基因插入pKC1139的ClaⅠ位点，得到的重组DNA即为所述重组载体。
【技术特征摘要】
1.构建重组载体的方法,是将葡聚糖酶基因插入PKC1139的ClaI位点，得到的重组DNA即为所述重组载体。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述葡聚糖酶基因编码如下a)或b)的蛋白质:a)氨基酸序列如SEQID N0.1所示的蛋白质；b)将SEQID N0.1中的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有降解纤维素活性的由a)衍生的蛋白质。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述葡聚糖酶基因的编码序列如SEQID N0.2 的第 208-1707 位。4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述葡聚糖酶基因的核苷酸序列是SEQID N0.2 的第 9-1707 位。5.由权利要求1-4中任一所述方法构建的重组载体。6.含有权利要求5所述重组载体的重...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴慧玲，刘伟成，董丹，刘霆，卢彩鸽，张涛涛，张殿朋，田兆丰，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：
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