一种转基因青蒿的环境安全评价方法技术

一种转基因青蒿的环境安全评价方法，该方法对转基因青蒿的农艺性状、抗逆性以及基因漂移进行测试，同时以野生型受体青蒿作对照，评估中设置的参数涵盖了转基因青蒿和其野生型受体差异性的各指标，为转基因青蒿的环境释放建立了模型，在说明两者实质等同性上具有重要示范意义，本发明专利技术从以上三个方面建立的评价体系操作简单，易于实现，直观性强，结果准确性高，该方法对转基因青蒿的环境安全评价提供了待测指标，为转基因青蒿品种的商业化风险评估提供了技术支撑。

Environmental safety assessment method for transgenic Artemisia annua

Environmental safety evaluation method for transgenic Artemisia annua, agronomic traits, the method of transgenic Artemisia annua resistance and gene flow were tested simultaneously with wild type receptor Artemisia as control, evaluation parameters are set to cover all indexes of transgenic Artemisia annua and its wild type receptor differences, for the environmental release of transgenic Artemisia annua model in the description, has important demonstration significance both substantial equivalence, the operation evaluation system of the invention is established from the above three aspects of the simple, intuitive, easy realization, high accuracy, the method of environmental safety evaluation of transgenic Artemisia annua provides indicators to be measured, and provides technical support for the commercial risk assessment of transgenic Artemisia annua varieties.

【技术实现步骤摘要】
一种转基因青蒿的环境安全评价方法
本专利技术属于转基因植物的安全评价领域，具体涉及一种转基因青蒿的环境安全评价方法。
技术介绍
疟疾(malaria)是由疟原虫所致的虫媒传染病。疟疾流行于102个国家和地区，据世界卫生组织(WHO)估计，有20亿人口居住在疾病区，特别是在非洲、东南亚和中、南美洲的一些国家，恶性疟死亡率极高。非洲地区的世界卫生组织(WHO)对这种疾病的负担是最重的，估计所有死亡中有90％的人死于疟疾，而5岁以下的儿童占因疟疾死亡的78％。目前，对疟疾最有效的治疗方法是以青蒿素为基础的联合疗法。青蒿素是从青蒿中分离出的倍半萜内脂药物，但青蒿的青蒿素含量很低，而青蒿素的人工合成则成本高，价格昂贵。利用基因工程方法是一种很有望提高青蒿素产量的方法，近年来，青蒿素生物合成的分子调控机制研究取得了显著性进展，青蒿素的生物合成途径中的几种编码关键酶基因，包括ADS，AaWRKY1，CYP71AV1和CPR，已经从青蒿中克隆。如：在唐克轩教授实验室，通过农杆菌介导的转化，转入CYP71AV1和CPR基因，获得了转基因青蒿GYR，该品系显著增加了青蒿素的含量。在商业化之前，转基因植物应该在环境释放实验中进行环境安全评价。然而，转基因(GM)植物的培育中，由于其潜在的生态及人类健康风险而受到关注，虽然在基因工程中只插入了一小段外源DNA序列，但是由此产生的新型的有机体可能导致杂草化或者环境生存的不耐受性，并且影响到生态环境等。因此，转基因植物的抗逆性和生存能力的问题，必须进行系统的环境安全评价。转基因植物在环境释放和商业化中仍有许多问题还没有答案。我国农业部(MOA)在1996年实施了转基因法规，在商业化前，所有实验研究、田间试验和环境释放的相关的生物安全评价都要求由转基因生物安全委员会进行评估。到目前为止，许多的转基因植物已经进行了田间试验，并且，有些已经商业化；然而，评估转基因青蒿在环境释放中的实验仍未见报道研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种转基因青蒿的环境安全评价方法，从形态学差异性、抗逆性以及基因漂移三个方面建立评估参数体系，本专利技术从以上三个方面建立的评价体系操作简单，易于实现，直观性强，结果准确性高，为转基因青蒿品种的商业化种植及评估提供了技术支撑。为了达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种转基因青蒿的环境安全评价方法，包括以下步骤：1)农艺性状形态学测定将转基因青蒿植株从温室内移栽至大田种植区域内，移植3-4个月后，测定植株的形态学参数，同时，以野生型青蒿作对照；2)抗逆性评价在温室中进行转基因青蒿的盐胁迫、干旱胁迫、除草剂耐受以及越冬能力评价，同时，以野生型青蒿作对照；3)基因漂移测定设置矩形实验场来进行基因漂移试验，其面积不低于5亩，含外源基因的转基因青蒿种植于中心点及其4-7个同心圆中，同心圆的半径从内到外以0.8-1.4m逐个增加，矩形实验场的最短边长应是同心圆最大半径的4-9倍，同心圆外种植野生型青蒿，同时，在该矩形实验场周围设置物理隔离区；在野生型受体青蒿种植区内，沿同心圆的8个以上方向设置不少于72个测试点，呈米字形，收获各测试点的青蒿种子，测定种子发芽率、并进行卡那霉素抗性筛选，对于抗卡那霉素的植株利用PCR方法进一步验证其是否含有插入的外源基因。进一步，步骤1)所述的生长形态参数为株高、冠幅、茎粗、种子发芽率、叶片干重、千粒重和叶片形状。又进一步，所述步骤1)中的生长形态参数中，对于株高、冠幅和茎粗，在植株的营养生长早期和中期分别测定；对于种子发芽率的测定过程为：取等量的转基因青蒿种子，清洗后分别播种至基质、水以及无菌培养基中，培养7-15天，按下式统计种子发芽率；种子发芽率＝(发芽种子数/播种种子数)×100。又，步骤1)所述农艺性状形态学参数中，千粒重的测定过程为：收集30-50株植株的种子，数出1000粒并测定种子的千粒重。进一步，步骤2)中，盐胁迫测定中，测定了叶片的相对含水量、过氧化物酶活性、游离脯氨酸和丙二醛含量；干旱胁迫实验在添加了PEG胁迫中进行，测定干旱胁迫中青蒿叶片中的游离脯氨酸、株高和复叶数差值；除草剂耐受性中所述的除草剂为非选择性除草剂和选择性除草剂。优选地，步骤3)中所述的矩形实验场的宽度不低于长度的1/2，在该矩形实验场周围种植玉米隔离带作为物理隔离区。进一步，步骤3)中，一个方向由内到外设置8～14个测试点，其中，测试点1～5之间每两点间隔0.8m，测试点6～10之间每两点间隔2.4m，测试点11～14之间每两点间隔4.8米。又优选地，步骤3)中，收获的青蒿种子来自植株的顶部、中部和下部，均匀采收。进一步，步骤3)中，抗卡那霉素的植株被移植到穴盘壮苗后，生长15-25天后，从每株幼苗上选取3-5片叶片进行DNA的提取。进一步，步骤3)中，导入了外源基因CYP71AV1和CPR的转基因青蒿的基因漂移距离为29.2m。通过基因工程提高青蒿中青蒿素的含量时，使参与青蒿素生物合成的限速酶基因进行过量表达是必不可少的，在提高了青蒿素产量的转基因青蒿植物中，CYP71AV1和CPR基因进行了过量表达，然而，转基因青蒿对于环境的影响是未知的，因此，本专利技术从农艺性状、抗逆性以及基因漂移等几个方面，来探讨转基因青蒿GYR和野生型受体是否具有相似的生存竞争能力。本专利技术中，依据个案分析原则，设置了形态学农艺性状差异性比较、耐盐性、耐旱性、耐除草剂、越冬能力，以及基因漂移方法测定，系统的评价了转基因青蒿的环境释放后带来的问题，设置的参数涵盖了转基因青蒿和其野生型受体差异性的各指标，为转基因青蒿的环境释放建立了模型，在说明两者实质等同性上具有重要意义，评估结果说明转基因青蒿和其野生型受体具有实质等同性，为其商业化生产奠定了基础。青蒿是异花授粉植物且自交的不亲和性，使得外源基因是很容易被检测出来。因此，转基因和传统植物之间的基因漂移应该同时评估。本专利技术的评估方法中，在基因漂移方法的测定中，将转基因青蒿植株作为一个花粉源栽培在圆圈中，可以有效捕捉由于风力或昆虫的携带等带来的各个方向的基因漂移，在监测基因漂移距离上有很好的示范作用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果：本专利技术通过对转基因青蒿和其野生型受体的形态学差异性、生存竞争能力、以及基因漂移等几个方面进行了转基因植物的环境风险评估，为转基因药用植物青蒿的环境安全评价平台的建立提供了参考。本专利技术涵盖了转基因青蒿从实验室层次进入商业化生产的环境释放这个必经过程，并且，在进行安全性评价的过程中，遵从了转基因植物环境安全评价的原则。即进一步评价了转基因青蒿对环境的影响；又根据个案分析原则，评价了其形态学农艺性状差异性、与环境适应能力、生存竞争能力、成为杂草的可能性以及其外源基因遗传物质向其他植物发生转移的可能性及其后果。为其它转基因植物的安全性评价体系的建立，提供了有益的参考模型，旨在为转基因青蒿环境安全性评价提供依据。附图说明图1为本专利技术实施例中转基因青蒿与野生型受体青蒿的株高评价结果。图2为本专利技术实施例中转基因青蒿与野生型受体青蒿的茎粗评价结果。图3为本专利技术实施例中转基因青蒿与野生型受体青蒿的冠幅评价结果。图4为本专利技术实施例中转基因青蒿与野生型受体青蒿的发芽率评价结果。图5为本专利技术实施例中转基因青蒿与野生型本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种转基因青蒿的环境安全评价方法，包括以下步骤：1)农艺性状形态学测定将转基因青蒿植株从温室内移栽至大田种植区域内，移植3‑4个月后，测定植株的形态学参数，同时，以野生型青蒿作对照；2)抗逆性评价在温室中进行转基因青蒿的盐胁迫、干旱胁迫、除草剂耐受性以及越冬能力评价，同时，以野生型青蒿作对照；3)基因漂移测定设置矩形实验场来进行基因漂移试验，其面积不低于5亩，含外源基因的转基因青蒿种植于中心点及其4‑7个同心圆中，同心圆的半径从内到外以0.8‑1.4m逐个增加，矩形实验场的最短边长应是同心圆最大半径的4‑9倍，同心圆外种植野生型青蒿，同时，在该矩形实验场周围设置物理隔离区；在野生型受体青蒿种植区内，沿同心圆的8个以上方向设置不少于72个测试点，呈米字形，收获各测试点的青蒿种子，测定种子发芽率、并进行卡那霉素抗性筛选，对于抗卡那霉素的植株利用PCR方法进一步验证其是否含有插入的外源基因。

【技术特征摘要】
1.一种转基因青蒿的环境安全评价方法，包括以下步骤：1)农艺性状形态学测定将转基因青蒿植株从温室内移栽至大田种植区域内，移植3-4个月后，测定植株的形态学参数，同时，以野生型青蒿作对照；2)抗逆性评价在温室中进行转基因青蒿的盐胁迫、干旱胁迫、除草剂耐受性以及越冬能力评价，同时，以野生型青蒿作对照；3)基因漂移测定设置矩形实验场来进行基因漂移试验，其面积不低于5亩，含外源基因的转基因青蒿种植于中心点及其4-7个同心圆中，同心圆的半径从内到外以0.8-1.4m逐个增加，矩形实验场的最短边长应是同心圆最大半径的4-9倍，同心圆外种植野生型青蒿，同时，在该矩形实验场周围设置物理隔离区；在野生型受体青蒿种植区内，沿同心圆的8个以上方向设置不少于72个测试点，呈米字形，收获各测试点的青蒿种子，测定种子发芽率、并进行卡那霉素抗性筛选，对于抗卡那霉素的植株利用PCR方法进一步验证其是否含有插入的外源基因。2.如权利要求1所述的转基因青蒿的环境安全评价方法，其特征在于，步骤1)所述的生长形态参数为株高、冠幅、茎粗、种子发芽率、叶片干重、千粒重和叶片形状。3.如权利要求2所述的转基因青蒿的环境安全评价方法，其特征在于，所述步骤1)中的生长形态参数中，对于株高、冠幅和茎粗，在植株的营养生长早期和中期分别测定；对于种子发芽率的测定过程为：取等量的转基因青蒿种子，清洗后分别播种至基质、水以及无菌培养基中，培养7-15天，按下式统计种子发芽率；种子发芽率＝(发芽种子数/播种种子数)×100。4.如权利要求2所述的转基因青蒿...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘华，唐雪明，王金斌，白蓝，蒋玮，吴潇，潘爱虎，贾军伟，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：上海,31