一种植物表达载体骨架及其应用制造技术

本发明专利技术属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种植物表达载体骨架。一种植物表达载体骨架，其特征在于：该T‑DNA的右边界到左边界之间依次包含如下元件：删除位点1，终止子1，筛选标记或报告基因1，启动子1，启动子2，筛选标记或报告基因2，终止子2，删除位点2，启动子3，多克隆位点，终止子3。本发明专利技术载体骨架容易更换筛选标记基因、报告基因、控制目标基因表达单元的启动子以及终止序列，适于对多种植物进行遗传转化，且具有较高的生物安全性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一种植物表达载体骨架。
技术介绍
植物基因工程能够对植物细胞进行遗传修饰，进而培育具有优良性状的新品种。植物表达载体是开展植物基因工程操作的基本要素，所包含的T-DNA区段(transfer-DNA)具有从农杆菌转移并整合到植物基因组中的特性，该区段通常包含目标基因表达单元和筛选报告基因表达元件，在植物的遗传转化过程中发挥非常关键的作用。随着植物转基因技术的发展，能够进行遗传转化操作的植物种类越来越多，目前常用的植物表达载体表现出了一定的局限性。第一，在遗传转化操作过程中，不同种类的植物对筛选剂敏感性差异较大。例如，卡拉霉素在双子叶植物的抗性筛选中较常用，而水稻、玉米等单子叶作物对卡拉霉素有一定抗性，如使用卡拉霉素作为筛选剂，容易出现假阳性植株。第二，大量研究显示，目标基因的时空表达特性，对转基因植物表型影响较大。这要求在植物表达载体中能够较容易地更换控制目标基因表达的启动子。第三，消费者对转基因商品的安全性越来越重视，常用的植物表达载体中含有从病毒、细菌中克隆的DNA序列元件，容易引起消费者的担忧。第四，国家相关部门拟定了可以商品化使用的抗性基因名录，带有名录以外抗性筛选基因的转基因植物将难以商业化推广使用。因此，构建易于在分子水平进行操作修饰的T-DNA，同时在植物基因组中减少引入目标基因表达单元以外的DNA，具有重要价值。
技术实现思路
本专利技术的目的为构建植物表达载体提供一种新选择。本专利技术的技术方案是一种植物表达载体骨架，该T-DNA的右边界到左边界之间依次包含如下元件：删除位点1，终止子1，筛选标记或报告基因1，启动子1，启动子2，筛选标记或报告基因2，终止子2，删除位点2，启动子3，多克隆位点，终止子3。具体的，所述的删除位点1和删除位点2为loxp位点。具体的，所述的启动子1和启动子2为pCaMV35S：：pGOS2(玉米GOS2基因的启动子)融合双向启动子。具体的，所述的启动子3为水稻组蛋白3基因的启动子pOsHISTONE3(pH3)、花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子pCaMV35S、泛素基因启动子pUBI、果实特异表达基因FBP7的启动子pFBP7或肌动蛋白基因启动子pACTIN。具体的，所述的终止子为NOS、PolyA或HST。具体的，所述的筛选标记或报告基因1为潮霉素磷酸转移酶基因HPT基因、新霉素磷酸转移酶基因NPTⅡ、双丙氨酰磷抗性基因Bar、绿色荧光蛋白基因GFP、红色荧光蛋白基因RFP或β-葡糖苷酸酶基因GUSplus基因；所述的筛选标记或报告基因2为HPT基因、NPTⅡ、Bar、GFP、RFP或GUSplus基因；且筛选标记或报告基因1和筛选标记或报告基因2不为同一个基因。具体的，右边界与终止子3之间的酶切位点为PvuⅠ、EcoRⅠ。具体的，所述的多克隆位点为SmaⅠ、SacⅠ、KpnⅠ、ApaⅠ、BamHⅠ、SalⅠ、PstⅠ、HpaⅠ、XbaⅠ。具体的，启动子3与loxp位点之间的酶切位点为HindⅢ。具体的，终止子2与筛选标记或报告基因2之间的酶切位点为XhoⅠ。具体的，筛选标记或报告基因2与pCaMV35S：：pGOS2融合双向启动子之间的酶切位点为XhoⅠ。具体的，pCaMV35S：：pGOS2融合双向启动子与筛选标记或报告基因1之间的酶切位点为MluⅠ。具体的，筛选标记或报告基因1与终止子1之间的酶切位点为MluⅠ。具体的，loxp位点与左边界之间的酶切位点为PvuⅠ。其中，目标基因表达单元区由启动子3、多克隆位点、终止子3构成，筛选标记或报告基因表达单元区由终止子2、筛选标记或报告基因2、pCaMV35S：：pGOS2融合双向启动子、筛选标记或报告基因1、终止子1构成。目标基因表达单元区的终止子3可由EcoRⅠ和多克隆位点中的任意限制性酶切除，并更换为其他终止子，包括但不限于NOS、PolyA、HST等具有转录终止功能的DNA片段；启动子3可由HindⅢ和多克隆位点中的任意限制性酶切除，并更换为其他启动子，包括但不限于pCaMV35S、pUBI、pFBP7、pACTIN等组成型或组织特异性表达启动子；多克隆位点用于插入目标DNA片段，包括但不限于具备完整ORF框的基因、RNAi片段、反义序列等。预留的HindⅢ和EcoRⅠ位点可用于切除目标基因表达单元，并引入其他DNA片段。筛选或报告基因表达单元区的GUSplus和HPT基因两端分别预留了XhoⅠ、MluⅠ酶切位点，可由相应的限制酶单酶切删除，并更换为其他筛选或报告基因，包括但不限于NPTII、Bar、GFP、RFP等；pCaMV35S：：pGOS2融合双向启动子由在双子叶植物中广泛组成型高表达的pCaMV35S启动子和在单子叶植物中组成型高表达的pGOS2(玉米GOS2基因的启动子，表达水平较高)启动子融合而成，具有双向高表达特性。两个loxp位点可由Cre重组酶识别，用于删除筛选和报告基因表达单元，为了尽量减少转基因植物基因组中非目标序列的引入，设计靠近目标基因表达单元区的loxp位点与HindIII位点相邻，另一端的loxp位点与PvuⅠ位点相邻。预留的两个PvuⅠ酶切位点可用于切取整个T-DNA区域(不包含左边界和右边界)，并根据需要置换到其他质粒载体骨架。本专利技术的有益效果：本专利技术载体骨架容易更换筛选标记基因、报告基因、控制目标基因表达单元的启动子以及终止序列，适于对多种植物进行遗传转化，且具有较高的生物安全性。附图说明图1、pD植物表达载体用不同限制性内切酶酶切电泳图；M为北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司产品MiddleDNAMarkerⅠ。图2、pD植物表达载体的T-DNA区结构；酶切位点1和2、3和4、5和6、7和8可分别用于切除或更换筛选标记或报告基因1或2，以及启动子3、终止序列3。酶切位点1和2、3和4、5和6、7和8每组酶不限于相同的酶切位点。具体到pD载体，酶切位点1、2、3、4、5、6、7、8分别为MluⅠ、MluⅠ、XhoⅠ、XhoⅠ、HindⅢ、XbaⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ，报告基因1和2分别为HPT和GUSplus，启动子3为pH3，终止序列3为HST。图3、pD植物表达载体以HPT作为筛选标记基因时对烟草、玉米等植物的遗传转化情况。图4、pD植物表达载体以GUSplus作为报告基因时，转化体的组织化学染色情况。左图是pD载体用于烟草遗传转化，阳性植株与对照叶片GUS染色情况，右图是pD载体用于玉米遗传转化，阳性植株与对照愈伤组织GUS染色情况。具体实施方式以下结合附图对本专利技术进行进一步的详细说明。除非另有说明，否则本专利技术实例中的试剂药品均为市售可得，方法均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell,2001)。实施例1、pD载体的构建(1)元件的扩增和组装从玉米基因组中扩增获得pGOS2启动子，并在两端引入HpaⅠ和XbaⅠ识别位点。扩增获得NOS终止子3，并在5’端引入SpeⅠ、MluⅠ识别位点，在3’端引入loxp、PvuⅠ位点。扩增序列TA克隆到pMD19-T载体，测序鉴定后，pMD19-pGOS2用XbaⅠ和HindⅢ双酶切，把pGOS2片段连入用SpeⅠ和HindⅢ双酶切的pMD19-NOS本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种植物表达载体骨架，其特征在于：该T‑DNA的右边界到左边界之间依次包含如下元件：删除位点1，终止子1，筛选标记或报告基因1，启动子1，启动子2，筛选标记或报告基因2，终止子2，删除位点2，启动子3，多克隆位点，终止子3。

【技术特征摘要】
1.一种植物表达载体骨架，其特征在于：该T-DNA的右边界到左边界之间依次包含如下元件：删除位点1，终止子1，筛选标记或报告基因1，启动子1，启动子2，筛选标记或报告基因2，终止子2，删除位点2，启动子3，多克隆位点，终止子3。2.如权利要求1所述的植物表达载体骨架，其特征在于：所述的删除位点1和删除位点2为loxp位点。3.如权利要求1或2所述的植物表达载体骨架，其特征在于：所述的启动子1和启动子2为pCaMV35S：：pGOS2融合双向启动子；所述的启动子3为pH3、pCaMV35S、pUBI、pFBP7或pACTIN。4.如权利要求1～3任一项所述的植物表达载体骨架，其特征在于：所述的终止子为NOS、PolyA或HST。5.如权利要求1～4任一项所述的植物表达载体骨架，其特征在于：所述的筛选标记或报告基因1为HPT基因、NPTⅡ、Bar、GFP、RFP或GUSplus基因；所述的筛选标记或报告基因2为HPT基因、NPTⅡ、Bar、GFP、RFP或GUSplus基因，且筛选标记或报告基因1和筛选标记或...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡明瑜，潘晓雪，白文钦，谢树章，王春萍，蒋晓英，杨小艳，吴红，林清，雷开荣，
申请(专利权)人：重庆市农业科学院，
类型：发明
国别省市：重庆;50