基于滚环扩增技术检测转基因物种的方法技术

本发明专利技术公开了基于滚环扩增技术检测转基因物种的方法，该方法利用可特异性连接环化的寡核苷酸链作为探针与转基因物种的靶基因杂交后在ＤＮＡ连接酶的作用下形成环化单链探针，该探针在恒温条件下被生物素复制引物滚动复制和支链扩增，产生含有多个串连重复片段的生物素化滚环扩增产物，扩增产物与钌标记的ＤＮＡ探针杂交，再通过链霉亲和素包被的磁珠分离、电化学发光检测，判断转基因的有无。本发明专利技术的滚环扩增检测方法中所扩增的基因并不是转基因物种的原基因序列而是探针序列，转基因物种的原基因只是提供了一个探针环化的互补支架，保证了扩增的安全性和特异性；另外所有的扩增过程都可在恒温下完成，无需ＰＣＲ仪，降低了对实验硬件的要求。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于转基因检测
，特别涉及一种基于滚环扩增技术检测转 基因物种的方法。
技术介绍
随着现代生物技术的发展，转基因食品已逐步进入普通百姓的生活。由于 转基因食品所具有的潜在非安全件，为保护广大消费者的权益，满足其选择权 和知情权以及出于国际贸易的需要，转基因食品的检测越来越引起各国政府和 有关食品监督机构的重视。目前转基因产品检测方法分为两大类-1、 免疫学检测法免疫学检测法是从蛋白质水平对转基因食品进行检测，即对外源蛋白质的测定。可将其分为Western杂交、酶联免疫法(ELISA)、试纸条法和快速检 测试剂盒法。免疫学检测法，其基本原理是通过抗原(antigen)抗体(antibody) 之间的特异反应来实现的。这种方法的不足在于第一，由于抗原抗体反应的 专一性，因此一种试剂盒只针对一特定转基因产物，无法高通量、快速地检测 具有多种混合成分的食品样品；第二，加工过的转基因食品中的蛋白质抗原性 很容易破坏，从而影响检测结果的准确性；第三，有些转基因食品不表达蛋 白质或表达量很低或很大时，则无法进行检测。2、 PCR检测法PCR检测法是目前转基因存在的检测方法屮最为成熟的，它具有灵敏度较 高、特异性强、可准确定量等优点。现阶段常用的PCR技术有定性PCR，定 量竞争PCR和实时荧光定量PCR， PCR—ELISA，巢式扩增PCR (Nested PCR) 和复合扩增PCR (Multiplex PCR)。但该项技术的检测结果也有可能与实际不 相符合，会出现假阴性或假阳件结果，即检测物质本身含有转基因特制而未被 检出，或是本身没有转基因物质，而检出有转基因成分。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种基于滚环扩增 技术检测转基因物种的方法。该方法设计一条靶基因探针，探针的5'端和3' 端能够与目标的检测基因序列互补配对，在完全互补配对的情况下，连接酶把能够完全配对的探针连接成环化的探针，再用一条5'端生物素化复制引物以该环化探针为模板进行滚环扩增，扩增出与环形探针模板互补的串联重复序列的DNA单链；然后将产物与钌标记的探针杂交，最后进行电化学发光检测。只有当探针能够与转基因物种的待测序列完全互补才能被连接酶连接成环化探针，从而能产生用于滚环复制的模板；而不含转基因的物种因为不能产生滚 环复制的模板，因此不能得到扩增产物；通过对扩增产物与钌探针杂交后进行 电化学发光检测能判断转基因的有无。本专利技术的目的通过下述技术方案实现一种基于滚环扩增技术检测转基因 物种的方法，包括以下步骤(1) 从转基因物种样品中提取样品的基因组DNA即靶基因1。(2) 将靶基因1与过量的靶基因探针2混合，90 95。C变性，然后自然 冷却到室温，靶基因1与靶基因探针2退火、杂交。(3) 然后加入2 5个单位(U) DNA连接酶，37'C下进行连接反应20 30分钟，耙基因探针2被DNA连接酶连接成环化探针3。(4) 在上述环化探针3中加入过量的与环化探针3互补的生物素化的复 制引物4、 10 15个单位(U) DNA聚合酶和1 3毫摩尔dNTPs，在37°C 进行滚环扩增复制反应90分钟左右，产生生物素化滚环扩增产物5。(5) 在室温下，步骤(4)得到的生物素化滚环扩增产物5与过量的钌标 记的核酸探针6杂交30 60分钟，得到杂交产物。(6) 将上述杂交产物与链霉亲和素包被的磁珠孵育大约20 30分钟，然 后用磁分离器分离，去掉上清，收集磁珠吸附的杂交产物于电化学发光仪器样 品池中。(7) 往样品池中加入三丙胺或二丁基乙醇胺，检测样品池中的三联P比啶 钌复合物产生的电化学发光信号确定样品中是否含有转基因产品。比较样品检 测的信号与非转基因样品的信号，当样品信号大于非转基因样品信号与三倍标 准偏差之和的信号时可判断样品为含有转基因的样品。所述步骤(1)的靶基因l提取方法如下对非粉末状的固体样品，采用5研磨处理成粉末状，然后提取样品中的DNA。对于液态样品，采用冷冻干燥法干燥并磨碎成粉末状。所述步骤(l)的转基因物种样品中含有的基因是CAMV35S启动子、NOS 终止子、Kmr(抗卡那霉素基因)、Nec/ (抗新霉素基因)、Kygf (抗潮霉素基因) 或Barr(抗草丁膦基因)的基因，以及人工插入基因组改变物种品质与功能的特 异的外源基因。所述步骤(l)的靶基因1为含有CAMV35S启动子、NOS终止子、Kmr(抗 卡那霉素基因)、Nec/ (抗新霉素基因)、Kygf (抗潮霉素基因)或Bar「(抗草丁 膦基因)的基因，以及人工插入基因组改变物种品质与功能的特异的外源基因。所述步骤(2)的靶基因探针2是一段线性单链DNA探针，其长度一般 为50 200个碱基长度，每条探针有一个5'磷酸末端和一个3'羟基末端。靶 基因探针2包括两个部分，分别为位于5'端和3'端的目标基因杂交区，以及 位于5，端和3，端的目标基因杂交区中的填充区。杂交区的序列与靶基因l完 全互补，并根据不同靶基因而变化，填充区则以最优化于滚环扩增条件而定。 当转基因物种样品中含有CAMV35S启动子时，所述靶基因探针2为5TGGGTG TTA CGT ACG GCA GAG GCA TC丁 TCA ACG A3'。所述步骤(2)的高温变性温度一般为90 95r，退火和杂交条件则依据 所检测的目标转基因的序列而定，但一般范围为20 50'C，也可以从变性温 度缓慢降温到室温执行退火和杂交步骤。所述歩骤(3)的DNA连接酶包括￡.co/z' DNA连接酶、T4 DNA连接酶、 Taq DNA连接酶或其他适合于DNA连接的酶。所述歩骤(4)的生物素化的复制引物4是一段5，端标记上生物素的DNA 单链，其长度为15 30个碱基长度为宜，它的序列应该与环化探针3的填充 区互补。当转基因物种样品中含有CAMV 35S启动子时，所述生物素化的复 制引物4为5'biotin-TTTTTTAGCGCTATCTTCA3，；所述复制引物4为5， -TTTTTT AGCGCTATCTTC A3 ，。所述歩骤(4)的DNA聚合酶包括￡.co// DNA polymerase (大肠杆菌DNA 聚合酶)、phage M2 DNA polymerase (噬菌体M2DNA聚合酶)、T5 DNA polymerase (T5 DNA聚合酶)、PRD1 DNA polymerase (PRD1 DNA聚合酶) 或者Phi29 DNA polymerase (Phi29 DNA聚合酶)等。dNTPs为商品化产品。所述步骤(5)钌标记的核酸探针6为标记上钌的核酸探针，其长度一般为15 30个碱基长度，其序列与生物素化滚环扩增产物5的重复序列互补。 当转基因物种样品中含有CAMV35S启动子时，所述歩骤(5)中钌标记的核 酸探针6为5 ， A AT CCA GTT AGA ATG AAG 3'。所述步骤(6)的链霉亲和素包被的磁珠可以采用商品化的产品，比如美 国Dynal Biotech公司的链霉亲和素包被的磁珠。所述步骤(7)的电化学发光检测仪器(见本申请人在先申请，申请号 02227608.4，专利技术名称电化学发光检测仪，见图2)包括样品池、恒电位仪 2、光本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于滚环扩增技术检测转基因物种的方法，其特征在于包括以下步骤：　　　　（１）从转基因物种样品中提取样品的基因组ＤＮＡ即靶基因１；　　　　（２）将靶基因１与过量的靶基因探针２混合，９０～９５℃变性，然后自然冷却到室温，靶基因１与靶基因探针２退火、杂交；　　　　（３）然后加入２～５个单位ＤＮＡ连接酶，３７℃下进行连接反应２０～３０分钟，靶基因探针２被ＤＮＡ连接酶连接成环化探针３；　　　　（４）在上述环化探针３中加入过量的与环化探针３互补的生物素化的复制引物４、１０～１５个单位ＤＮＡ聚合酶和１～３毫摩尔ｄＮＴＰｓ，在３７℃进行滚环扩增复制反应９０分钟，产生生物素化滚环扩增产物５；　　　　（５）在室温下，将步骤（４）得到的生物素化滚环扩增产物５与过量的钌标记的核酸探针６杂交３０～６０分钟，得到杂交产物；　　　　（６）将上述杂交产物与链霉亲和素包被的磁珠孵育２０～３０分钟，然后用磁分离器分离，去掉上清，收集磁珠吸附的杂交产物于电化学发光仪器检测样品池中；　　　　（７）往检测样品池中加入三丙胺或二丁基乙醇胺，检测样品池中的三联吡啶钌复合物产生的电化学发光信号确定样品中是否含有转基因产品；　　　　所述步骤（２）的靶基因探针２是一段线性单链ＤＮＡ探针，其长度为５０～２００个碱基长度，每条探针有一个５’磷酸末端和一个３’羟基末端；靶基因探针２包括两个部分，分别为位于５’端和３’端的目标基因杂交区，以及位于５’端和３’端的目标基因杂交区中的填充区，所述杂交区的序列与靶基因１完全互补；　　　　所述步骤（４）的生物素化的复制引物４是一段５’端标记上生物素的ＤＮＡ单链，其长度为１５～３０个碱基长度，它的序列与环化探针３的填充区互补；　　　　所述步骤（５）钌标记的核酸探针６为标记上钌的核酸探针，其长度为１５～３０个碱基长度，其序列与生物素化滚环扩增产物５的重复序列互补。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：邢达，周小明，朱德斌，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]