神经干细胞培养扩增方法及所用培养基技术

本发明专利技术公开了一种神经干细胞培养扩增方法，包括将不同来源的神经干细胞用本发明专利技术所述培养液培养、添加营养补充液、更换新鲜培养液、挑选一定大小的神经球传代等步骤，还提供了相关的培养液、营养补充液等组合物的配方。本发明专利技术所述方法显著提高了静态培养下神经干细胞的增殖效率，并且不使用抗生素，成本较低，适合工业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞培养扩增领域。本专利技术特别涉及用于神经干细胞培养扩增的培养基以及使用所述培养基培养扩增神经干细胞的方法。
技术介绍
神经干细胞(Neural Stem Cell, NSC)是存在于胚胎和成体脑、脊髄等神经组织中的ー种干细胞，是ー类具有分裂潜能和自更新能力的母细胞，可通过不对等的分裂方式分化成神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等神经组织的各类细胞，也可转分化成血细胞和骨骼肌细胞。在脑、脊髄等所有神经组织中，不同的神经干细胞类型产生的子代细胞种类不同，分布也不同。目前的科学技术已经可以在体外培养扩增神经干细胞，用于生命科学研究、药物筛选测试、临床应用研究等领域。神经干细胞通常的分离提取方法是，采用化学或机械方法将胚胎或成体的脑、脊髓等神经组织分散成单细胞后，或者对培养的干细胞进行定向诱导分化后，对获得的细胞混合液初步培养一段时间，由于神经干细胞具有形成神经球的特性，可以通过挑选神经球的方法从中分离获得少量神经干细胞。神经干细胞通常的培养扩增方法是，将用前段所述方法获得的神经球作为初始种子，接种入含血清或不含血清的培养液，置于5% C02、37°C条件下培养，每培养到一定程度就挑选合适的神经球进行消化传代，实现细胞数量扩增，以满足研究或测试需求的数量和质量。(《人胚神经干细胞的分离培养和鉴定》，罗树伟，谢常青，卢光，中南大学学报(医学版)，2004，29 (2) : 129-131 ；《早期人胚神经干细胞分布及分离培养》，吕海侠，翟伟，刘勇等，西安交通大学学报(医学版)，2003年4月第24卷第2期97-100 ；《胎鼠脊髄源性神经干细胞分离培养与鉴定》，李勇，敬晓棋，窦忠英，中国生物工程杂志，2005，25 (6)25-30 ；《诱导人脐血神经干细胞向神经细胞分化的研究》，季旭东，高超，杨月景，河南医学研究，2005年9月第14卷第3期215-219 ;《异体和自体骨髄源神经干细胞周围神经移植实验研究》，李贵涛，徐如祥，姜晓丹等，中国矫形外科杂志，2007年7月第13卷第14期，1087-1089 ；《人和小鼠神经干细胞的体外培养的分化研究》，吴益民，喻红，林丽珠等，复旦学报(自然科学版)，2002年2月第41卷第I期，57-62)。由于血清具有成分复杂、质量不稳定、价格昂贵等缺点，虽然有血清时培养扩增效率较高，然而无血清培养仍然成为发展趋势，目前一般采用添加了生长因子、抗生素等成分的DMEM或者DMEM/F12培养液作为神经干细胞的无血清培养液(《体外血清预培养促进神经干细胞増殖》，万虹，历俊华，张绍东，中国临床康复，2006，10 (45))。神经干细胞有静态培养和动态培养两种方式，前者是用细胞培养瓶放在温箱中静态条件下培养，在无血清条件下扩增效率较低(《哺乳动物神经干细胞扩增技术研究进展》，董良，齐瀚实，生物技术，2005，15(4));后者是利用细胞培养生物反应器在旋转等动态条件下培养，扩增效率较高，然而生物反应器价格昂贵，并且部分情况下为了实验的方便或由于实验条件的要求，神经干细胞不适合用生物反应器进行培养扩増。此外，目前神经干细胞培养还需要添加抗生素，有可能对神经干细胞的进ー步应用造成影响。
技术实现思路
本专利技术提供了一种新的神经干细胞培养扩增方法，其对神经球的挑选、培养液的配方和换液时机等接种培养エ艺进行了改进，实现了在静态培养条件下神经干细胞10-15天的扩增效率达到7-14倍，并且本专利技术所述方法不需要添加抗生素，更好的满足科研和エ业化生产的需要。在ー个方面，本专利技术提供了一种神经干细胞培养扩增方法，所述方法包括 (a)将神经干细胞接种在包含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)的DMEM/F12或DMEM培养基中培养；(b)2、3或4天后在培养基中添加5-20%体积的营养补充液并继续培养，其中所述营养补充液是包含IXB27添加剤，IXN2添加剤，I. 0-3. OmM的L-谷氨酰胺，0. 5-1. 5mM的丙酮酸钠，0. 5-1. 5mM 的 N こ酰半胱氨酸(NAC)，50_150ng/ml 的 bFGF，50_150ng/ml 的 EGF以及l-15ng/ml的白血病抑制因子(LIF)的DMEM/F12或DMEM培养基；(c)监测培养基中形成的神经球直径，当60%以上、优选70%以上神经球直径高于阈值吋，分离直径高于所述阈值的神经球，消化后收获，其中所述阈值为200-500 u m,例如为 250 u m、300 u m、350 u m、400 u m 或 450 u m ；(d)未挑中的直径小于所述阈值的剰余细胞保留在原培养基中，将培养基移除1/2-1/4体积，然后添加与移除体积相同体积的(a)中所述的包含bFGF和EGF的培养基继续培养；(e)在(a)接种神经干细胞10、11、12、13、14或15天后通过合并(C)中收获的细胞和(d)继续培养所得的细胞而收获细胞。本专利技术人发现通过本专利技术方法可以实现神经干细胞的高效扩増，10-15天的扩增效率达到7-14倍。本专利技术所述扩增效率是指扩增后细胞数与扩增前细胞数的比值。本专利技术所述神经干细胞可以是不同动物例如哺乳动物例如灵长类动物例如人、啮齿类动物例如鼠等的神经干细胞，而且所述神经干细胞可以得自不同来源，例如可以是商购获得的神经球冻存液或神经干细胞细胞系，或者自行从动物神经组织或其他组织(如脐带血、脐带)中分离提取，或者是由其他细胞经诱导分化而来，比如体细胞(通过iPSC技术诱导)，间充质干细胞，胚胎干细胞(包括极小类胚胎干细胞)，亚全能干细胞，人类视网膜色素上皮细胞等。在一个实施方案中，所述神经干细胞是间充质干细胞向神经方向诱导获得的神经干细胞。本专利技术(a)中所述的培养可以使用本领域已知的任何方法进行，例如參见(《干细胞原理、技术与临床》第21章第2节，赵春华主编，化学エ业出版社，2006年5月第一版)。在一个实施方案中，所述培养基是包含bFGF和EGF的DMEM/F12培养基。所述培养基还可以包含其他本领域已知用于培养神经干细胞的物质，例如丙酮酸钠、谷氨酰胺、NAC和LIF。在本专利技术的一个实施方案中，(a)中使用的培养基为包含IXB27添加剤，IXN2添加剂，I. 0-3. OmM 的 L-谷氨酰胺，0. 5-1. 5mM 的丙酮酸钠，0. 5-1. 5mM 的 NAC，5_30ng/ml 的bFGF, 5-30ng/ml的EGF以及l_15ng/ml的LIF的DMEM/F12培养基。在一个实施方案中，(a)的培养基中所述bFGF的浓度为5-30ng/ml，例如20ng/ml。在一个实施方案中，(a)的培养基中所述EGF的浓度为5-30ng/ml，例如20ng/ml。本专利技术中所用DMEM/F12或DMEM培养基是本领域熟知的培养基，可以购自任何商业来源。例如，所述培养基可以购自Invitoogen，其配方可以例如參见Invitrogen 公司网站。例如，DMEM 配方可參见 http://www. invitrogen. com/ site/us/en/home/support/Product-TechnicaI-Resourc es/media_formuiation. 11,html ；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种神经干细胞培养扩增方法，所述方法包括：(a)将神经干细胞接种在包含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)的DMEM或DMEM/F12培养基中培养2、3或4天；(b)添加5？20％体积的营养补充液并继续培养，其中所述营养补充液是包含1×B27添加剂，1×N2添加剂，1.0？3.0mM的L？谷氨酰胺，0.5？1.5mM的丙酮酸钠，0.5？1.5mM的N乙酰半胱氨酸(NAC)，50？150ng/ml的bFGF，50？150ng/ml的EGF以及1？15ng/ml的白血病抑制因子(LIF)的DMEM或DMEM/F12培养基；(c)监测培养基中形成的神经球直径，当60％以上、优选70％以上神经球直径高于阈值时，分离直径高于所述阈值的神经球，消化后收获，其中所述阈值为200？500μm，例如为250μm、300μm、350μm、400μm或450μm；(d)留在原培养基中的直径小于所述阈值的剩余细胞在将培养基移除1/2？1/4体积并添加与移除体积相同体积的(a)中所述的包含bFGF和EGF的培养基后继续培养；(e)在(a)接种神经干细胞后第10、11、12、13、14或15天通过合并(c)收获的细胞和(d)继续培养所得的细胞而收获细胞。...

【技术特征摘要】
1.一种神经干细胞培养扩增方法，所述方法包括 (a)将神经干细胞接种在包含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)的DMEM或DMEM/F12培养基中培养2、3或4天； (b)添加5-20%体积的营养补充液并继续培养，其中所述营养补充液是包含IXB27添加剂，1XN2添加剤，I. 0-3. OmM的L-谷氨酰胺，0. 5-1. 5mM的丙酮酸钠，0. 5-1. 5mM的Nこ酰半胱氨酸(NAC), 50_150ng/ml 的 bFGF, 50_150ng/ml 的 EGF 以及 l_15ng/ml 的白血病抑制因子(LIF)的DMEM或DMEM/F12培养基； (c)监测培养基中形成的神经球直径，当60%以上、优选70%以上神经球直径高于阈值时，分离直径高于所述阈值的神经球，消化后收获，其中所述阈值为200-500 u m,例如为.250 u m、300 u m、350 u m、400 u m 或 450 u m ； (d)留在原培养基中的直径小于所述阈值的剰余细胞在将培养基移除1/2-1/4体积并添加与移除体积相同体积的(a)中所述的包含bFGF和EGF的培养基后继续培养； (e)在(a)接种神经干细胞后第10、11、12、13、14或15天通过合并(C)收获的细胞和(d)继续培养所得的细胞而收获细胞。2.权利要求I的方法，其中(a)的培养基为包含1XB27添加剤，1XN2添加剤，I.0-3. OmM 的 L-谷氨酰胺，0. 5-1. 5mM 的丙酮酸钠，0. 5-1. 5mM 的 NAC，5_30ng/ml 的 bFGF，.5-30ng/ml 的 EGF 以及 l_15ng/ml 的 LIF 的 DMEM 或 DMEM/F12 培养基。3.权利要求2的方法，其中(a)的培养基中bFGF的浓度为16_24ng/ml，例如20ng/ml。4.权利要求2的方法，其中(a)的培养基中EGF的浓度为16_24ng/ml，例如20ng/ml。5.权利要求1-4任ー项的方法,其中所述(a)的培养基中或者所述营养补充液中L-谷氨酰胺的浓度独立地为I. 6-2. 4mM，例如2mM。6.权利要求1-4任ー项的方法,其中所述(a)的培养基中或者所述营养补充液中丙酮酸钠的浓度独立地为0. 8-1. 2mM，例如ImM。7.权利要求1-4任ー项的方法,其中所述(a)的培养基中或者所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：金宜强，刘军，杨立敏，
申请(专利权)人：上海安集协康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：