一种猪极小胚胎样干细胞分离与纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种快速有效的极小胚胎样干细胞(very small embryonic-like stem cells，VSELs)分离和纯化方法，包括以下步骤 ：1. 猪骨髓液红细胞裂解后经含FBS的RPMI 1640培养基重悬细胞分离出猪骨髓总单个核细胞；2. 加入FcR封闭液，耦合CD133抗体或Lin抗体的免疫磁珠，过柱分选，获得猪骨髓CD133（+）或Lin（-）细胞群；3. 采用CD133、CD45、Lin抗体标记流式细胞分选术获得猪骨髓CD133 (+) Lin (-) CD45 (-)极小胚胎样干细胞。本发明专利技术具有高效率、高纯度、高度稳定等优势，是首次分离、纯化出偶蹄类动物猪的VSELs，丰富了现有的干细胞库，有利于对大型偶蹄动物VSELs进一步研究，使VSELs更接近于临床应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及干细胞工程、组织工程与生物起搏等领域,特别是涉及极小胚胎样干细胞分离与纯化领域。
技术介绍
极小胚胎样干细胞(verysmallembryonic-likestemcells，VSELs)是一类体积非常细小、数量极少（占骨髓单个核细胞的0.01%-0.04%）、具有多能性的非造血干细胞。VSELs于2006年由美国肯塔基州路易斯维尔大学MariuszRatajczak等人从小鼠骨髓单个核细胞中成功分离并命名,细胞表型为Sca-1（+）lin（-）CD45（-），直径2-4μm。该团队进一步研究发现人骨髓、脐带血、外周血、脑、心肌、肾脏、胰腺等组织中同样存在，细胞表型为SSEA-4+/Oct-4+/CD133+/CXCR4+/Lin-/CD45-，直径为4-6μm。人和鼠VSELs的生物学特性主要包括：较血小板大，红细胞小，细胞核大，含常染色质，表达原始多能干细胞标志Oct-4和Nanog，具有多分化潜能特性，与胚胎干细胞(ESCs)或诱导的胚胎样干细胞(iPSs)有相似之处,即能在体内分化为所有三种胚系的细胞如血细胞、骨细胞、肌细胞和神经细胞等。该细胞与衰老有关，随着年龄的增长其含量会进一步的降低，并且在体外单独培养的情况下很难扩增。由于VSELs可以向三个胚层分化，且无免疫排异、无伦理问题，被认为具有替代胚胎干细胞的潜力，其在科学界深受重视。已表明在心肌梗塞的鼠动物模型以及心肌梗塞和中风患者中循环水平大大增加，也显示出VSELs在体内修复损伤心肌、骨骼、胰岛、神经组织和免疫系统的有效性。尽管有人推测VSELs有可能改变再生医学，但鉴于VSELs是体内非常稀少的成体多能干细胞，分离、培养技术复杂，而且正如加州斯坦福大学Weissman、波兰亚捷隆大学的Dulak等教授按照Ratajczak团队最初所描述的方法重复实验并广泛分析，却无法从鼠的骨髓、人的脐带血中分离到极小的胚胎样干细胞，或者在直径小于7微米的老鼠骨髓细胞中，未能发现与多能性有关的分子标签，纷纷质疑其存在和价值，因此，如何改进分离与纯化技术是VSELs研究中急需解决的问题。因VSELs体积小、数量少和贴壁能力弱，通常的骨髓非造血干细胞分离方法即贴壁分离法和密度梯度离心法所获取的细胞得率相当低，故不适合VSELs的分离。红细胞裂解法、流式细胞分选法或免疫磁珠分选法虽可以用于人和鼠VSELs的分离，但单独一种方法均不能达到满意效果，单纯采用免疫磁珠法，细胞繁杂，纯度不够；单纯采用流式分选尤其是处理大量细胞样品需达到一定数量的目标细胞，一次须24-36小时，易损伤和污染细胞。另外，迄今为止，尚缺乏大型偶蹄动物VSELs的分离或纯化报道。
技术实现思路
针对目前极小胚胎样干细胞制备难度大、周期长、效率低、纯度不高，且上述任何一种方法均不能达到满意的效果，本专利技术提供了一种猪极小胚胎样干细胞分离与纯化方法，包括以下步骤：（1）猪骨髓液红细胞裂解后经含FBS的RMPI1640培养基重悬细胞分离出猪骨髓总单个核细胞；（2）按照1×108/100ul细胞浓度加入FcR封闭液，耦合CD133抗体或Lin抗体的免疫磁珠，过柱分选，获得猪骨髓CD133（+）或Lin（-）细胞群；（3）采用CD133、CD45、Lin抗体标记的流式细胞分选术获得猪骨髓CD133(+)Lin(-)CD45(-)极小胚胎样干细胞。本专利技术将红细胞裂解法、免疫磁珠分选法（MACS）和流式细胞分选术（FACS）三道程序科学组合，50ml猪骨髓液分离时间缩短至4-6小时，纯度达到95%以上、细胞得率高、细胞数量达到1×105以上。与采用红细胞裂解法和经典流式细胞分选（公开号103396988A）相比效率提高3-4倍，单纯采用流式分选如达到一定数量级的目标细胞，每次须24-36小时、耗时长，细胞大量损伤且少量VSELs有可能已分化为较成熟细胞；与采用某一种单抗磁珠分选法（公开号102229910A）相比纯度显著增高。专利技术提出的高效VSELs的分离、方法具有巨大的应用前景，为VSELs的临床研究提供了重要的技术保障。作为本方法的优选，采用红细胞裂解法分离猪骨髓总单个核细胞，首先将适龄猪麻醉固定在清洁工作台上，无菌操作下于猪髂后上棘或髂前上棘行骨髓穿刺术，获得足够量并充分肝素化的骨髓，离心去脂，加入红细胞裂解液，吸除上清液，4℃下加入0.02%EDTA洗涤得细胞悬液。用含2%FBS的RPMI1640培养基重悬细胞，轻轻吹打，4℃下500rpm离心10分钟。用2ml含2%FBS的RPMI1640培养基重悬细胞，经40um滤网过滤后分离,进而离心、洗涤、过滤、去除碎片后得到总单核细胞。作为本方法的优选，所选取用于麻醉的适龄猪为2-4月龄的小型成体猪，体重(35±5kg)，雌雄不限，由扬州农业大学实验动物中心提供，所有实验动物均受到人道对待，符合美国国立卫生研究院颁布的《实验动物管理和使用指南》。实验方案获得扬州大学实验动物伦理委员会和江苏省苏北人民医院伦理委员会批准。作为本方法的优选，所述的获得猪骨髓CD133（+）细胞群，步骤包括：(1)加FcR非特异性吸附剂封闭细胞将上述分离的总单个核细胞悬液4℃下500rpm离心10分钟，按照1×108/300ul细胞浓度加入缓冲液重悬细胞，按照1×108/100ul细胞浓度加入FcR封闭液；(2)加CD133抗体免疫磁珠标记细胞按照1×108/100ul细胞浓度加入耦合CD133抗体的免疫磁珠标记细胞。充分混匀，2℃～8℃孵育30分钟。按照1×108/2ml细胞浓度加入缓冲液清洗细胞，4℃500rpm离心10分钟。小心吸除上清液后按照1×108/500ul细胞浓度加入缓冲液重悬细胞；(3)细胞过柱免疫磁珠分选获得CD133（+）细胞将细胞悬液置于免疫磁珠分选仪上过柱，每1ml细胞悬液使用一个MS型号的分选柱，吸取PBS缓冲液500uL注入分选柱中浸润，分选柱充分浸润后注入1ml细胞悬液，待细胞悬液流尽后，再从分离柱上端添加PBS缓冲液1ml冲洗，用15ml无菌管接取流出的细胞悬液，分选柱内磁珠结合的细胞即为CD133（+）细胞。作为本方法的优选，所述的获得猪骨髓Lin（-）细胞群，步骤包括：(1)加FcR非特异性吸附剂封闭细胞将上述分离的总单个核细胞悬液，4℃下500rpm离心10分钟，按照1×108/400ul细胞浓度加入缓冲液重悬细胞。按照1×108/100ul细胞浓度加入FcR封闭液；(2)加Lin抗体免疫磁珠标记细胞按照1×1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪极小胚胎样干细胞的分离与纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）猪骨髓液红细胞裂解后经含FBS的RPMI 1640培养基重悬细胞分离出猪骨髓总单个核细胞；（2）按照1×108/100ul细胞浓度加入FcR封闭液，耦合CD133抗体或Lin抗体的免疫磁珠，过柱分选，获得猪骨髓CD133（+）或Lin（‑）细胞群；（3）采用CD133、CD45、Lin抗体标记的流式细胞分选术获得猪骨髓CD133 (+) Lin (‑) CD45 (‑)极小胚胎样干细胞。

【技术特征摘要】
1.一种猪极小胚胎样干细胞的分离与纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）猪骨髓液红细胞裂解后经含FBS的RPMI1640培养基重悬细胞分离出猪骨髓总单个
核细胞；
（2）按照1×108/100ul细胞浓度加入FcR封闭液，耦合CD133抗体或Lin抗体的免疫磁珠，
过柱分选，获得猪骨髓CD133（+）或Lin（-）细胞群；
（3）采用CD133、CD45、Lin抗体标记的流式细胞分选术获得猪骨髓CD133(+)Lin(-)
CD45(-)极小胚胎样干细胞。
2.根据权利要求1所述的猪极小胚胎样干细胞的分离与纯化方法，其特征在于，所述
的分离出猪骨髓总单个核细胞，步骤包括：
（1）猪的麻醉
选取2-4月龄、体重(35±5kg)小型成体猪，予速眠新II和地西泮适量肌肉注射后20分
钟，待猪处于适度麻醉时，将其固定于动物手术室洁净操作台上；
(2)骨髓穿刺
以髂后或髂前上棘为穿刺点，于该点周围10cm范围备皮，继之用1%碘伏消毒三次，穿无
菌手术衣、带无菌手套后进行骨髓穿刺，用含有肝素水的无菌注射器抽取骨髓50mL于预先
抗凝的无菌试管中，并反复摇动试管以防骨髓液凝固；
(3)去除脂肪及泡沫
将骨髓液平均分装于四只50mL离心管中，4℃条件下1000rpm离心10分钟去除脂肪及
泡沫；
(4)红细胞裂解
按照红细胞裂解液与骨髓液4:1的比例加入红细胞裂解液，轻轻旋转离心管以充分混
匀，室温下孵育10分钟，4℃下500rpm离心10分钟，缓慢吸除上清液；按照裂解液与骨髓液
2:1比例再次加入裂解液重悬细胞，室温孵育10分钟，4℃下500rpm离心10分钟，吸除上清
液；
4℃下加入0.02%EDTA洗涤得细胞悬液；
(5)总单个核细胞的分离
用30mL含2%FBS的RPMI1640培养基重悬细胞，轻轻吹打，4℃下500rpm离心10分钟，用
2ml含2%FBS的RPMI1640培养基重悬细胞，经40um滤网过滤后，以细胞计数板计数备用。
3.根据权利要求1所述的猪极小胚胎样干细胞的分离与纯化方法，其特征在于，所述
的获得猪骨髓CD133（+）细胞群，步骤包括：
(1)加FcR非特异性吸附剂封闭细胞
将上述分离的总单个核细胞悬液4℃下500rpm离心10分钟，按照1×108/300ul细胞浓
度加入缓冲液重悬细胞，按照1×108/100ul细胞浓度加入FcR封闭液；
(2)加CD133抗体免疫磁珠标记细胞
按照1×108/100ul细胞浓度加入耦合CD133抗体的免疫磁珠标记细胞，充分混匀，2℃～
8℃孵育30分钟，按照1×108/2ml细胞浓度加入缓冲液清洗细胞，4℃500rpm离心10分钟，
小心吸除上清液后按照1×108/500ul细胞浓度加入缓冲液重悬细胞；
(3)细胞过柱免疫磁珠分选获得CD133（+）细胞
将细胞悬液置于免疫磁珠分选仪上过柱，每1ml细胞悬液使用一个MS型号的分选柱，吸
取PBS缓冲液500uL注入分选柱中浸润，分选柱充分浸润后注入1ml细胞悬液，待细胞悬液流
尽后，再从分离柱上端添加PBS缓冲液1ml冲洗，用15ml无菌管接取流出的细胞悬液，分选柱
内磁珠结合的细胞即为CD133（+）细胞。
4.根据权利要求1所述的猪极小胚胎样干细胞的分离与纯化方法，其特征在于，所述
的获得猪骨髓Lin（-）细胞群，步骤包括：
(1)加FcR非特异性吸附剂封闭细胞
将上述分离的总单个核细胞悬液，4℃下500rpm离心10分钟，按照1×108/400ul细胞浓
度加入缓冲液重悬细胞，按照1×108/100ul细胞浓度加入FcR封闭液；
(2)加Lin抗体免疫磁珠标记细胞
按照1×108/100ul细胞浓度加入耦合Lin抗体免疫磁珠标记细胞，充分混匀，2℃～8℃
孵育30分钟，按照1×108/5ml细胞浓度加入缓冲液清洗细胞，4℃500rpm离心10分钟，吸除
上清液后按照1×108/500ul细胞浓度加入缓冲液重悬细胞；
(3)细胞过柱免疫磁珠分选获得Lin（-）细胞
将细胞悬液置于免疫磁珠分选仪上过柱，每1ml细胞悬液使用一个MS型号的分选柱，吸
取PBS缓冲液500uL浸润分选柱，注入1ml细胞悬液，细胞悬液过柱后冲洗分选柱三次...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾翔，李碧春，顾健，孙加斌，金凯，蒋一秀，罗雪，朱业，孙磊，胡茂志，石青青，朱睿，王竟悟，顾艺荀，苗书航，
申请(专利权)人：江苏省苏北人民医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32