一种收集猪复杂形态胚胎的方法技术

本发明专利技术公开了一种收集猪复杂形态胚胎的方法，属于兽医学技术领域。本发明专利技术根据猪子宫的形态特征和利用重力的原理建立了一种能够简易快速的收集猪孵化后球形、卵圆、管状及线性等复杂形态胚胎的方法。该方法可避免对球形、卵圆、管状及线性胚胎胚外组织的损坏，有利于观察复杂的猪胚胎形态，为猪孵化后胚胎及胚外组织的研究具有重要的意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种简易快速的收集猪复杂形态胚胎的方法，属于兽医学

技术介绍
猪是重要的医学模型动物。尽管目前对猪胚胎孵化后发育比较详细的数据，但是相对模式生物小鼠来说，猪胚胎发育数据非常有限，构成了猪在生物医学方面发展的瓶颈。猪孵化后胚胎已进入子宫腔，它们的发育经历较漫长的着床前时间，期间胚胎外观形态发生了复杂的形态变化，包括圆形、卵圆形、管状和长达近1米的线形形态。目前虽然有研究报道猪胚胎的形态，且给出了收集胚胎时所用冲胚液配方[HassounR,SchwartzP,RathD,ViebahnC,J.Germlayerdifferentiationduringearlyhindgutandcloacaformationinrabbitandpigembryos.JAnat.2010；217(6):665-78；duPuyL,LopesSM,HaagsmanHP,RoelenBA.Analysisofco-expressionofOCT4,NANOGandSOX2inpluripotentcellsoftheporcineembryo,invivoandinvitro.Theriogenology.2011；75(3):513-26.]，但是各个实验室配方有差异。HallVJ[HallVJ,ChristensenJ,GaoY,SchmidtMH,HyttelP.Porcinepluripotencycellsignalingdevelopsfromtheinnercellmasstotheepiblastduringearlydevelopment.DevDyn.2009；238(8):2014-24.]给出了胚胎收集的操作操作方法，但其方法是需要挤压子宫，从而易破坏胚胎的胚外组织，不易分离单个胚胎。猪子宫是由子宫颈、子宫体和子宫角组成，阔韧带把子宫角和子宫体连接成整体。子宫的形态特征是子宫体方向粗，子宫角在输卵管方向细。基于猪孵化后胚胎形态的复杂性和子宫的特征，本专利技术在前期实验摸索的基础上，提出了一种能够简易快速的收集猪复杂形态胚胎的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种简易快速的收集猪复杂形态胚胎的方法。为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：本专利技术的一种简易快速的收集猪复杂形态胚胎的方法，包括以下步骤：1)将屠宰后妊娠母猪的子宫颈位置结扎，然后取其子宫及附属器官，置于预热的冲胚液中，37℃保温；2)应用止血钳分别在子宫体与子宫角相连的位置以及子宫角与输卵管相连的位置处结扎，剔除子宫阔韧带及附属器官，用剪刀将两侧子宫角从子宫体上分离下来；3)在子宫角与输卵管相连的位置处以垂直于子宫角的方向用剪刀剪开小口；4)用注射器装满冲胚液，然后在子宫角剪开小口位置，把冲胚液注入子宫角，提起子宫角两端，晃动子宫角；5)摆顺子宫角后，将子宫体与子宫角相连的位置处的止血钳去除，用移液器枪头疏通，并使开口位于收集器皿中；6)提起子宫角细端，根据重力使冲胚液及胚胎从子宫角的细端向粗端自动流出；此时，用手在液体流出位置控制液体流出量，收集液体于培养器皿中，完成冲胚；7)每部分子宫角按照步骤4)-6)重复两次。在本专利技术中，优选的，所述的冲胚液为含有5％(v/v)FBS的0.02MpH7.2-7.6的磷酸缓冲液。优选的，每次冲胚时所用的冲胚液的体积为100-150ml。在本专利技术中，优选的，保温时间不超过1小时，且冲胚时不挤压子宫角。在本专利技术中，优选的，用手在液体流出位置控制液体流出量，流出量以覆盖10cm培养皿皿底为宜，将液体收集于多个培养皿中。猪胚胎发育至囊胚时期，胚胎已全部进入子宫。子宫内，囊胚孵化，孵化后胚胎形态会经历球形、卵圆形、管状和线性的变化。在此过程中，胚胎也会在子宫内移动，最后在15天左右均匀分布到子宫角，与子宫建立联系，发生着床。10天的胚胎呈现卵圆形，11天的胚胎出现管状和线性，12天的胚胎以线性为主，13天的胚胎则全部形成长度上米的线性胚胎。在方法改变之前，我们收集到第12.5天的胚胎如图2A所示，胚胎呈现线团状，缠绕在一起。在缠绕在一团的胚胎中进行单个完整胚胎分离难度大、耗费时间长，很难观察到完整胚胎形态。经过分离能得到如图2B的线性胚胎，可见胚胎出现断裂。应用本专利技术方法收集第10.5天的胚胎，如图3A所示，可获得完整的球形和管状胚胎。收集第12.5天的胚胎，利用本方法较容易的分离出单个完整的线性胚胎，如图3B。利用新方法我们从16头妊娠的母猪中收集了胎龄为第6-14天的胚胎，此阶段胚胎形态有圆形、球形、管状和线性胚胎。因此，说明利用本专利技术的方法可以获得各个天数的完整形态胚胎。附图说明图1为子宫结扎示意图。图2为使用现有方法收集的妊娠12.5天(D12.5)的胚胎；其中图2A为分离前胚胎，图2B为分离后胚胎；图3为采用本专利技术方法收集的胚胎；其中图3A为妊娠10.5天(D10.5)的胚胎，图3B为分离后妊娠12.5天(D12.5)的胚胎。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。实施例11、准备工作：1)妊娠10.5天母猪；2)冲胚液：2000ml0.02MpH7.2-7.6磷酸缓冲液(PhosphateBufferedSaline)加100mlFBS(FetalBovineSerum)过滤灭菌，4度保存。用时提前37℃预热。3)器皿耗材：托盘、止血钳、剪刀，注射器、10cm培养皿、移液枪枪头2、方法步骤：1)将屠宰后妊娠10.5天母猪的子宫颈位置结扎，然后取其子宫及附属器官，置于预热的冲胚液中，37℃保温；2)应用止血钳分别在子宫体与子宫角相连的位置以及子宫角与输卵管相连的位置处结扎(子宫结扎示意图如图1所示)，剔除子宫阔韧带及附属器官，用剪刀将两侧子宫角从子宫体上分离下来；3)在子宫角与输卵管相连的位置处以垂直于子宫角的方向用剪刀剪开小口；4)用100ml注射器装满冲胚液，然后在子宫角剪开小口位置，把冲胚液注入子宫角，提起子宫角两端，轻柔的晃动子宫角；5)摆顺子宫角后，将子宫体与子宫角相连的位置处的止血钳去除，用移液器枪头疏通，并使开口位于收集器皿中；6)提起子宫角细端，根据重力使冲胚液及胚胎从子宫角的细端向粗端自动流出；此时，用手在液体流出位置控制液体流出量，流出量以覆盖10cm培养皿皿底为宜，将液体收集于多个培养皿中，完成冲胚；7)每部分子宫角按照步骤4)-6)重复两次。3、效果：应用本方法收集第10.5天的胚胎，如图3A所示，可见采用该方法可获得完整的球形和管状胚胎。注意事项：1)屠宰到冲胚的时间，尽可能的缩短时间，保证在1h内进行；2)避免挤压子宫角，控制冲胚速度。实施例21、准备工作：1)妊娠12.5天母猪；2)冲胚液：2000ml0.02MpH7.2-7.6磷酸缓冲液(PhosphateBufferedSaline)加100mlFBS(FetalBovineSerum)过滤灭菌，4度保存。用时提前37℃预热本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种简易快速的收集猪复杂形态胚胎的方法，其特征在于包括以下步骤：1)将屠宰后妊娠母猪的子宫颈位置结扎，然后取其子宫及附属器官，置于预热的冲胚液中，37℃保温；2)应用止血钳分别在子宫体与子宫角相连的位置以及子宫角与输卵管相连的位置处结扎，剔除子宫阔韧带及附属器官，用剪刀将两侧子宫角从子宫体上分离下来；3)在子宫角与输卵管相连的位置处以垂直于子宫角的方向用剪刀剪开小口；4)用注射器装满冲胚液，然后在子宫角剪开小口位置，把冲胚液注入子宫角，提起子宫角两端，轻柔的晃动子宫角；5)摆顺子宫角后，将子宫体与子宫角相连的位置处的止血钳去除，用移液器枪头疏通，并使开口位于收集器皿中；6)提起子宫角细端，根据重力使冲胚液及胚胎从子宫角的细端向粗端自动流出；此时，用手在液体流出位置控制液体流出量，收集液体于培养器皿中，完成冲胚；7)每部分子宫角按照步骤4)‑6)重复两次。

【技术特征摘要】
1.一种简易快速的收集猪复杂形态胚胎的方法，其特征在于包括以下步骤：1)将屠宰后妊娠母猪的子宫颈位置结扎，然后取其子宫及附属器官，置于预热的冲胚液中，37℃保温；2)应用止血钳分别在子宫体与子宫角相连的位置以及子宫角与输卵管相连的位置处结扎，剔除子宫阔韧带及附属器官，用剪刀将两侧子宫角从子宫体上分离下来；3)在子宫角与输卵管相连的位置处以垂直于子宫角的方向用剪刀剪开小口；4)用注射器装满冲胚液，然后在子宫角剪开小口位置，把冲胚液注入子宫角，提起子宫角两端，轻柔的晃动子宫角；5)摆顺子宫角后，将子宫体与子宫角相连的位置处的止血钳去除，用移液器枪头疏通，并使开口位于收集器皿中；6)提起子宫角细端，根据重力使冲胚液及胚胎从...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙瑞珍，刘忠华，雷蕾，单智焱，翁晓刚，申景岭，
申请(专利权)人：哈尔滨医科大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23