本发明专利技术公开了一种高浓度玻璃化液及石斑鱼胚胎冷冻保存方法，所述玻璃化液包括基础稀释液60%、渗透性抗冻剂35%和非渗透性抗冻剂5%；其中所述基础稀释液包括NaCl2 4.72 g/L，CaCl2·2H2O 1.46g/L，KCl 0.865g/L，MgCl2·6H2O 4.86g/L和NaHCO3 0.19 g/L，溶解在蒸馏水中；所述渗透性抗冻剂包括1,2‑丙二醇15.75%、甲醇10.5%和甘油8.75%；所述非渗透性抗冻剂是蔗糖或海藻糖。所述方法包括：高浓度渗透和非渗透性玻璃化液的配制，洗脱液配制，冷冻胚胎时期的筛选，胚胎五步渗透平衡，胚胎快速冷冻保存，胚胎解冻、洗脱和培养。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于低温生物学中鱼类胚胎低温保存
，具体涉及一种高浓度渗透和非渗透性玻璃化液及石斑鱼胚胎超低温冷冻保存方法。
技术介绍
胚胎冷冻保存对于长期保存鱼类全基因组遗传信息具有重要的意义，但是自从20世纪70年代Blaxter’s(1975)首次进行鱼类配子冷冻保存实验至今，60多年来鱼类胚胎冷冻保存技术进展缓慢，主要由于鱼卵体积大，具有双层卵膜结构，大的卵间隙，含有大量水分，丰富的卵黄和脂肪滴等特点，在-196℃冷冻保存鱼类胚胎很难成活，迄今，国际上尚未建立鱼类胚胎超低温冷冻保存的有效技术。在美国路易斯安娜州立大学农业中心的TierschT和MazikPM博士(2000)合著的《CryopreservationinAquaticSpecies》这本权威专著中，将鱼类胚胎冷冻保存列为迄今世界上尚未攻克的难题之一。美国国家动物园和保护研究中心的Hagedorn等(1997,2004)及伦敦大学自然科学与应用研究学院的ZhangT等(2005)以模式动物斑马鱼(Daniorerio)为研究材料，针对鱼类胚胎对水和抗冻剂的渗透性、抗冻剂毒性、不同时期胚胎对冷冻的敏感性、以及胚胎渗透动力学等进行了研究，但至目前在-196℃也未获得冷冻保存成活的完整胚胎。在国内上海理工大学低温生物工程室的ZhangX.S.等(1989)利用慢速降温方法对鲤鱼(Cyprinuscarpio)胚胎进行冷冻保存，从液氮中保存20min的16粒胚胎中获得了3粒复活胚胎。长江水产研究所的章龙珍等(2002)对泥鳅胚孔封闭期胚胎利用玻璃化冷冻获得4粒复活胚，发育至肌节期后停止发育，但以上研究都未获得重复成活的胚胎。中国水产科学研究院黄海水产研究所的田永胜等(2005)和Chen等(2005)对牙鲆、鲈鱼、大菱鲆等海水鱼类胚胎超低温冷冻保存技术进行研究，获得了冷冻成活的胚胎，但成活率相当低、很难重复，几种海水鱼类冷冻成活胚胎总计99粒。近年来国内外对鱼类胚胎超低温保存技术进行了大量的研究，但始终未形成可靠的冷冻保存技术方法，特别是对名贵鱼类品种―石斑鱼胚胎冷冻保存，国际上未有其他研究者的相关报导。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决鱼类胚胎中水分含量高、卵膜厚、抗冻剂难以渗透、在冷冻中易造成冰晶损伤的问题，以及高浓度、高渗透性抗冻剂造成的渗透损伤问题，以及冷冻保存后胚胎中抗冻剂的洗脱问题，提出了一种高浓度渗透和非渗透性玻璃化液，并同时提出了石斑鱼胚胎超低温冷冻保存方法。为了实现上述目的，本专利技术采用下述技术方案予以实现：本专利技术提供了一种高浓度渗透和非渗透性玻璃化液，均为体积或质量百分数，包括基础稀释液60％、渗透性抗冻剂35％和非渗透性抗冻剂5％；其中所述基础稀释液包括NaCl24.72g/L，CaCl2·2H2O1.46g/L，KCl0.865g/L，MgCl2·6H2O4.86g/L和NaHCO30.19g/L，溶解在蒸馏水中；所述渗透性抗冻剂包括1,2-丙二醇15.75％、甲醇10.5％和甘油8.75％；所述非渗透性抗冻剂是蔗糖或海藻糖。本专利技术还提供了一种石斑鱼胚胎超低温冷冻保存方法，步骤为：1)配制玻璃化液：采用权利要求1或2的配方配制高浓度渗透和非渗透性玻璃化液，将所述玻璃化液采用基础稀释液分别稀释成1/4、1/3、1/2、2/3和1倍的梯度溶液；2)配制洗脱液：在所述基础稀释液中加入蔗糖，配制成蔗糖洗脱液；3)筛选冷冻胚胎时期：将胚胎在22-24℃海水培养，利用显微镜观察，等发育至胚体形成期、肌节期、尾芽期进行冷冻保存；4)胚胎五步渗透平衡：将发育到步骤3)所述时期的胚胎分别在1/4、1/3、1/2、2/3和1倍的玻璃化液梯度溶液中进行五步渗透平衡，在每一梯度液中平衡6min，共30min；5)胚胎快速冷冻保存：将上述平衡处理后的胚胎连通玻璃化液一起吸入麦管中，热压封口，将麦管直接、快速投入液氮中冷冻保存；6)胚胎解冻、洗脱和培养：将麦管从液氮中取出，直接浸入水浴中解冻，然后打开麦管封口，利用步骤2)中配制的洗脱液将麦管中的胚胎冲洗到培养皿中进行洗脱；之后添加22-24℃灭菌海水冲洗1次，再加入灭菌海水在恒温下进行培养。为了缓解胚胎从高浓度的玻璃化进入海水导致渗透压突然降低对胚胎的损害，防止胚胎突然吸水膨胀产生的伤害，所述步骤2)中蔗糖洗脱液的浓度为4.278％。进一步的，所述步骤5)中液氮的温度为-196℃。进一步的，所述步骤6)中解冻是在37℃水浴中，解冻时间30-50s。进一步的，所述步骤6)中洗脱时间为10min。与现有技术相比，本专利技术的优点和积极效果是：本专利技术首先研制了高浓度的渗透性和非渗透性抗冻剂相结合的玻璃化液，一方面提高了玻璃化液胚胎外渗透力和脱出胚胎中水分的能力，防止了胚胎冷冻中过多水份生成冰晶对胚胎细胞的损伤；另一方面降低了单独使用高浓度渗透性抗冻剂对胚胎产生的毒性作用。渗透性抗冻剂1,2-丙二醇(PG)、甲醇(MeOH)、甘油(Gly)的分子量较小，可以通过卵膜渗透进入胚胎内部，提高细胞溶质浓度，降低细胞质结冰的冰点，达到在低温下保护细胞的目的，但是高浓度的渗透性抗冻剂对细胞具有极强毒性作用，易导致胚胎死亡。为了降低渗透性抗冻剂的毒性，对单一抗冻剂毒性进行了筛选，筛选了毒性较低的抗冻剂1,2-丙二醇。但是单一抗冻剂1,2-丙二醇的渗透力较低，于是将1,2-丙二醇与以上其它小分子渗透性抗冻剂以3：2的比例配制成两种抗冻剂相结合的玻璃化液，筛选出了毒性较低的渗透性较强的玻璃化液40％PM(PG:MeOH＝3:2)。为了进一步降低PM对胚胎的毒性作用，又在PM中以不同的比例(1:1，2:1，3:1，4:1)加入了甘油(Gly)，发现PMG3能够提高胚胎的成活率，说明多种渗透性抗冻剂相结合的玻璃化液能够降低对胚胎的毒性。非渗透性抗冻剂蔗糖(S)和海藻糖(T)具有较大的分子量，难于通过卵膜渗透进入胚胎，但其具有较强的脱水能力。由于鱼类胚胎中含有大量的水份，为了进一步提高玻璃化对胚胎的脱水能力，防止在冷冻中生成冰晶对胚胎的损伤，因此在以上筛选出的渗透性玻璃化液中加入了5％的非渗透性抗冻剂，筛选出了PMG3T和PMG3S两种多成份的渗透性和非渗透性抗冻剂组成的玻璃化液，既提高了玻璃化液胚胎外渗透力和脱出胚胎中水分的能力，防止了胚胎中过多水份在冷冻时生成冰晶对胚胎细胞的损伤，又降低了单独使用高浓度渗透性抗冻剂对胚胎产生的毒性作用；从而达到了对胚胎在超低温冷冻下的保护作用，实现了石斑鱼胚胎超低温冷冻保存的成活。在得到上述新型的玻璃化液的基础上，本专利技术采用胚胎五步渗透平衡方法，胚胎由低浓度玻璃化液逐次进入高浓度玻璃化液，既提高了胚胎对玻璃化液的适应能力，又能够逐次有效的脱去胚胎中过多的水份，同时降低了高浓度玻璃化液对胚胎的损伤，提高了胚胎在玻璃化液中处理的成活率。在解冻后利用4.278％的蔗糖液洗脱胚胎可以有效的缓解胚胎从高浓度的玻璃化进入海水导致渗透压突然降低对胚胎的损害，防止了胚胎突然吸水膨胀产生的伤害；通过以上技术方法的使用从而达到在超低温下冷冻保存胚胎的目的。利用本专利技术冷冻保存七带石斑鱼和云纹石斑鱼各期胚胎，重复获得了248粒成活的胚胎，复活率可达9.93％，并且孵化出鱼苗206尾本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高浓度渗透和非渗透性玻璃化液，其特征在于，均为体积或质量百分数，包括基础稀释液60%、渗透性抗冻剂35%和非渗透性抗冻剂5%；其中所述基础稀释液包括NaCl2 4.72 g/L，CaCl2·2H2O 1.46 g/L，KCl 0.865 g/L， MgCl2·6H2O 4.86 g/L 和 NaHCO3 0.19 g/L，溶解在蒸馏水中；所述渗透性抗冻剂包括1,2‑丙二醇 15.75%、 甲醇 10.5%和甘油 8.75%；所述非渗透性抗冻剂是蔗糖或海藻糖。
【技术特征摘要】
1.一种高浓度渗透和非渗透性玻璃化液，其特征在于，均为体积或质量百分数，包括基础稀释液60%、渗透性抗冻剂35%和非渗透性抗冻剂5%；其中所述基础稀释液包括NaCl24.72g/L，CaCl2·2H2O1.46g/L，KCl0.865g/L，MgCl2·6H2O4.86g/L和NaHCO30.19g/L，溶解在蒸馏水中；所述渗透性抗冻剂包括1,2-丙二醇15.75%、甲醇10.5%和甘油8.75%；所述非渗透性抗冻剂是蔗糖或海藻糖。2.一种石斑鱼胚胎超低温冷冻保存方法，其技术特征，步骤为：1）配制玻璃化液：采用权利要求1的配方配制高浓度渗透和非渗透性玻璃化液，将所述玻璃化液采用基础稀释液分别稀释成1/4、1/3、1/2、2/3和1倍的梯度溶液；2）配制洗脱液：在所述基础稀释液中加入蔗糖，配制成蔗糖洗脱液；3）筛选冷冻胚胎时期：将胚胎在22-24℃海水培养，利用显微镜观察，等发育至胚体形成期、肌节期、尾芽期进行冷冻保存；4）胚胎五步渗透平衡：将发育到步骤3）所述时期的胚胎分别在1...
【专利技术属性】
技术研发人员：田永胜，陈张帆，段会敏，唐江，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。