脂肪组织冻存液及脂肪组织冻存方法技术

本发明专利技术涉及生物医药技术领域，具体涉及一种脂肪组织冻存液及脂肪组织冻存方法。所述冻存液含有体积百分数为4％～6％的二甲基亚砜、质量百分数为0.5％～10％的羟乙基淀粉以及质量百分数为10％～20％的人血白蛋白。所述冻存方法包括：1)、对脂肪组织样本清洗后将其移入装有缓冲液的离心管中离心；2)、将脂肪组织移至新的离心管内并剪成碎块，加缓冲液并离心；3)、将脂肪组织移出并与预冷的脂肪组织冻存液混合得到混合液，将所述混合液冷冻后移入液氮中保存。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医药
，具体地涉及一种脂肪组织冻存液及脂肪组织冻存方法。
技术介绍
间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是干细胞家族的重要成员，源于发育早期的中胚层和外胚层。间充质干细胞是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，属于非终末分化细胞，它既有间质细胞，又有内皮细胞及上皮细胞的特征。间充质干细胞在体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、软骨、骨、肌肉、肌腱、神经、肝、心肌、胰岛β细胞和内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能。间充质干细胞分布广泛，被证实能够从多种组织中分离得到。由于间充质干细胞具有增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于规模化制备等特征，故被认为是细胞治疗中最有前景的一个方向。在临床上，MSCs目前被用于研究各种疾病，包括：移植物抗宿主病、心肌梗死、克罗恩病、多发性硬化、系统系红斑狼疮、肝硬化等，取得了良好的效果。此外，间充质干细胞还具有支持造血和促进造血干细胞植入的功用。因此，间充质干细胞为一些难治性疾病的治疗提供了全新的方案，在医学史上具有里程碑意义。脂肪干细胞(adipose-derivedstemcells，ASCs)又称脂肪来源间充质干细胞，首次由Zuk等在2001年从人类脂肪组织中分离出来，这群细胞具备多向分化潜能和稳定的增殖能力，且外形特征与间充质干细胞相符。因其具备取材容易、获得率高，创伤小和不存在伦理学争议等优势，近些年成为诸多学者的研究热点。脂肪干细胞目前已被证实能够向成骨细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞以及神经元分化，多项动物疾病模型疗效试验充分证实其在潜在的临床应用价值。此外，脂肪干细胞在整形美容方面应用广泛，如隆胸、乳房整形、面部年轻化、以及皱纹和瘢痕修复等，是组织工程和再生医学重要的种子细胞来源。采用合适的方法冻存脂肪组织，并在组织复苏后从中获取活性良好的脂肪干细胞，将为其在临床应用上奠定基础。因此本领域迫切需要开发新颖有效的且适合脂肪组织的冻存方法。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术确定了一种新可临床用脂肪组织的长期冻存方法：以供体脂肪为原料，通过脂肪样本预处理、长期组织冻存充质干细胞的方法。此法具有易于操作、可规模化、不受时间限制等优点，做到“一次吸脂、多次使用”、不限组织和细胞、更丰富用途、利于临床多种需求。与现有的直接分离脂肪间充质干细胞并进行细胞冻存更为简便，同时可以节约成本和避免在实验室长期培养带来的微生物污染和细胞分化等风险。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种脂肪组织冻存液，所述冻存液含有体积百分数为4％～6％的二甲基亚砜、质量百分数为0.5％～10％的羟乙基淀粉以及质量百分数为10％～20％的人血白蛋白。本专利技术将具有细胞毒性但目前尚无法替代的渗透性保护剂二甲基亚砜(DMSO)的浓度大幅度的降低，从传统的10％最低降至5％，再佐以其他大分子非渗透性保护剂如羟乙基淀粉、人血白蛋白制成可直接用于保存临床软组织工程用脂肪组织的冻存液。该细胞制剂中的成分DMSO为临床级且浓度较低，通过洗涤后将最大程度的避免对人体的毒副作用，故而能够确保该冷冻保护剂保存的脂肪组织用于人体是绝对安全的。优选的，如上所述的脂肪组织冻存液，所述冻存液含有体积百分数为4％～6％的二甲基亚砜、质量百分数为3.5％～7％的羟乙基淀粉以及质量百分数为13％～17％的人血白蛋白。优选的，如上所述的脂肪组织冻存液，所述冻存液的溶剂为复方电解质注射液；所述复方电解质注射液含有氯化钠5.26±0.4g/L、葡萄糖酸钠5.02±0.4g/L、三水醋酸钠3.68±0.3g/L、氯化钾0.37±0.05g/L、六水氯化镁0.30±0.05g/L。一种脂肪组织冻存方法，包括如下步骤：1)、对脂肪组织样本清洗后将其移入装有缓冲液的离心管中离心；2)、将脂肪组织移至新的离心管内并剪成碎块，加缓冲液并离心；3)、将脂肪组织移出并与预冷的脂肪组织冻存液混合得到混合液，将所述混合液冷冻后移入液氮中保存。脂肪组织由一系列复杂的细胞群组成，包括成熟的脂肪细胞，前体脂肪细胞，纤维细胞，动脉平滑肌细胞，内皮细胞和脂肪间充质干细胞。脂肪组织不仅能够为生物医学再生领域和细胞治疗提供大量所需的干细胞，同时还能够直接作为自体移植物用于外科整形。早在上世纪80年代末，自体脂肪移植就逐渐得到外科医生的认可并用于临床。脂肪移植虽是一种较为理想的软组织缺损填充手段，但通常移植后脂肪组织体积只能保持在移植时的50％左右，且移植成活率较低。因此，临床上仍需要通过少量、反复、多次移植来达到满意的填充效果。如果能实现一次抽取足够量的脂肪并进行冷冻保存，在需要时复苏，则会减轻对患者多次抽脂造成的痛苦。目前关于脂肪组织低温冻存剂的研究较少，而最佳冷冻保存条件对临床应用也具有重要的研究价值。使用无异源成分的冻存保护剂更符合未来往临床方向延伸的目标。目前脂肪方面的应用技术主要包括细胞提取及冻存，鲜有脂肪组织冻存。本专利技术联合使用渗透性保护剂和非渗透性保护剂，以保持冻存过的脂肪组织的细胞活力和生物学功能。优选的，所述缓冲液为生理盐水、PBS或TBS。优选的，如上所述的脂肪组织冻存方法，所述脂肪组织样本为新鲜样本或冷藏保存的样本；所述冷藏保存的样本保存温度为0℃～4℃，保存时间≤48h。优选的，如上所述的脂肪组织冻存方法，在步骤1)和步骤2)中，所述离心的条件为2800rpm～3200rpm离心5min～10min。离心后，脂肪组织中的油脂会悬于表层，每次离心后都需要把表层油脂吸去，随后再将脂肪组织转移到新的离心管或容器中进行操作，剩余液体和红细胞随离心管废弃，这是为了避免离心管内壁的油脂和其他细胞对脂肪组织的污染。优选的，如上所述的脂肪组织冻存方法，在步骤2)中，碎块的大小为0.1mm3～2mm3。优选的，如上所述的脂肪组织冻存方法，在步骤3)中，脂肪组织与预冷的脂肪组织冻存液混合的体积比为(1～2)：(1～2)。优选的，如上所述的脂肪组织冻存方法，所述预冷的脂肪组织冻存液的温度为0℃～4℃。优选的，如上所述的脂肪组织冻存方法，在步骤3)中，将所述混合液冷冻后移入液氮中保存的操作具体包括：将所述混合液装于冻存管内，将所述冻存管在0℃～5℃下平衡10min～30min，然后转入-80℃冻存2h～16h，最后转入液氮保存。优选的，冻存管在0℃～5℃下平衡10min～30min的操作在装有新鲜异丙醇的程序降温盒中进行。慢冻是为了防止降温过快导致细胞内外水迅速结晶化，导致细胞结构破坏、蛋白质变性、pH改变等不良后果，进而对细胞造成损害。慢冻还能使细胞缓慢失水，减少胞内结晶的形成从而保护细胞。本专利技术主要提供了一种临床用脂肪组织长期冻存方法，能够保持脂肪组织的生物活性不发生改变，同时也可在复苏后进行脂肪干细胞的分离扩增，甚至洗涤后直接进行软组织填充等外科手术的临床需求。其中我们将具有细胞毒性但目前尚无法替代的渗透性保护DMSO的浓度大幅度的降低，从传统的10％最低降至5％，再佐以其他大分子非渗透性保护剂如羟乙基淀粉、人血白蛋白和复方电解质注射液制成可直接用于临床软组织工程的脂肪组织。该细胞制剂中的成分DMSO为临床级且浓度较低，通本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脂肪组织冻存液，其特征在于，所述冻存液含有体积百分数为4％～6％的二甲基亚砜、质量百分数为0.5％～10％的羟乙基淀粉以及质量百分数为10％～20％的人血白蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种脂肪组织冻存液，其特征在于，所述冻存液含有体积百分数为4％～6％的二甲基亚砜、质量百分数为0.5％～10％的羟乙基淀粉以及质量百分数为10％～20％的人血白蛋白。2.根据权利要求1所述的脂肪组织冻存液，其特征在于，所述冻存液含有体积百分数为4％～6％的二甲基亚砜、质量百分数为3.5％～7％的羟乙基淀粉以及质量百分数为13％～17％的人血白蛋白。3.根据权利要求1或2所述的脂肪组织冻存液，其特征在于，所述冻存液的溶剂为复方电解质注射液；所述复方电解质注射液含有氯化钠5.26±0.4g/L、葡萄糖酸钠5.02±0.4g/L、三水醋酸钠3.68±0.3g/L、氯化钾0.37±0.05g/L、六水氯化镁0.30±0.05g/L。4.一种脂肪组织冻存方法，其特征在于，包括如下步骤：1)、对脂肪组织样本清洗后将其移入装有缓冲液的离心管中离心；2)、将脂肪组织移至新的离心管内并剪成碎块，加缓冲液并离心；3)、将脂肪组织移出并与预冷的脂肪组织冻存液混合得到混合液，将所述混合液冷冻后移入液氮中保存。5.根据权利要求4所述的脂肪组织冻存方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜小春，陈茜，戴玲华，
申请(专利权)人：杭州易文赛生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33