用于检测真菌的引物对及其应用和检测方法技术

本发明专利技术提供了一种用于检测真菌的引物对及其应用和检测方法，涉及生物技术领域。该用于检测真菌的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物。该引物对对白色念珠菌、光滑假丝酵母、近平滑假丝酵母、克柔假丝酵母、都柏林假丝酵母、热带假丝酵母、卡氏枝孢霉、须毛癣菌、黑曲霉、烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、新生隐球菌、肺囊菌和紫色毛癣菌的检测下限均可达10CFU/mL，简化了样本中真菌检测的手段和成本。本。本。

【技术实现步骤摘要】
用于检测真菌的引物对及其应用和检测方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种用于检测真菌的引物对及其应用和检测方法。

技术介绍

[0002]微生物检验是细胞制剂等生物制品质量控制的重要内容，其内容主要包括以培养方法检测是否有菌体、病毒等微生物的污染。常规检测方法通常有形态学检查、培养法、药敏试验和免疫学检测等，生物制品较常用的方法是培养法，但培养法耗时长，一般需要14天，个别生长缓慢的均则需要更长时间，对于阳性结果不能快速做出判断，而且培养法阳性检出率不高。
[0003]聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)实现了对单一微生物的检测，相比于传统培养方法虽然具有特异、灵敏、耗时短等优点，但是传统PCR只能检测单个物种，对于可能存在多种微生物污染的样本的检测，则需要重复操作，且存在容易漏检的风险。因此如何改进利用PCR原理检测真菌的手段是目前有待解决的问题。
[0004]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供一种操作简单、成本低并适用于多种真菌污染的样本的快速且高灵敏度地检测产品和方法。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术特采用如下技术方案：
[0007]根据本专利技术的一个方面，提供了一种用于检测真菌的引物对，包括正向引物和反向引物；
[0008]正向引物为：F：5'
‑
CCTTRCGAGAAATCAAAGTCTTTGG/>‑
3'(SEQ ID NO.1)；
[0009]反向引物为：R：5'
‑
CCTTMTTGTGTCTGGAMMTGGYGAGT
‑
3'(SEQ ID NO.2)；
[0010]其中R表示A或G，Y表示C或T，M表示A或C。
[0011]本专利技术提供的引物对以真菌的18SrRNA基因保守区为结合位点，能够扩增如下种类的真菌：白色念珠菌、光滑假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌、都柏林假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、卡氏枝孢霉、须毛癣菌、黑曲霉、烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、新生隐球菌、肺囊菌和紫色毛癣菌。
[0012]可选的实施方式中，所述正向引物和所述反向引物的工作浓度分别独立的为8～12μM，例如可以为但不限于为8、9、10、11或12μM，或上述任意两点之间的范围值。所述正向引物和所述反向引物的工作浓度分别独立的优选为10μM。
[0013]根据本专利技术的另一个方面，还提供了一种用于检测真菌的试剂或试剂盒，该试剂或试剂盒包含上述引物对。
[0014]可选的实施方式中，所述试剂或试剂盒还包括PCR扩增酶、缓冲组分、金属离子、盐、荧光染料、表面活性剂、dNTP、阳性对照和阴性对照中的至少一种。
[0015]根据本专利技术的另一个方面，还提供了上述引物对，或上述试剂或试剂盒在检测真菌中的应用，上述试剂或试剂盒可用于检测如下真菌中的至少一种：白色念珠菌、光滑假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌、都柏林假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、卡氏枝孢霉、须毛癣菌、黑曲霉、烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、新生隐球菌、肺囊菌和紫色毛癣菌。需要说明的是，本专利技术提供的应用是非诊断和治疗目的的。
[0016]根据本专利技术的另一个方面，还提供了一种检测真菌的方法，该方法包括使用上述引物对，或上述试剂或试剂盒扩增待测样本。需要说明的是，本专利技术提供的方法是非诊断和治疗目的的。
[0017]可选的实施方式中，所述待测样本包括食品样本、药品样本和试剂样本中的至少一种。
[0018]可选的实施方式中，所述方法为荧光定量PCR，包括如下步骤：将从待测样本中提取的总DNA为模板，使所述试剂或试剂盒，进行荧光定量PCR反应；收集所述荧光定量PCR反应的荧光信号，所述荧光信号用于结果分析。所述结果分析包括但不限于定性、半定量或定量分析。可选的实施方式，根据待测样本是否出现扩增曲线，定性的判断待测样本中是否存在真菌菌体；可选的实施方式，根据待测样本的Ct值，依据本领域已知的、常规的相对荧光定量的计算方法半定量待测样本中的菌体数量；可选的实施方式，通过构建标准曲线，并根据所述荧光信号计算所述待测样本中所含有的菌体数量。
[0019]可选的实施方式中，所述荧光定量PCR为通过在反应体系中添加荧光染料，例如添加SYBR
TM
Green来获取荧光信号。
[0020]可选的实施方式中，当所述待测样本的Ct值为小于40，有明显的扩增曲线，且空白对照的Ct值大于40时，无明显的扩增曲线时，所述荧光信号用于结果分析。
[0021]可选的实施方式中，所述方法还包括制备梯度浓度的若干标准菌体悬液，建立菌体梯度浓度的对数值与Ct值的标准曲线；所述标准菌体包括如下菌体的标准菌体：白色念珠菌、光滑假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌、都柏林假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、卡氏枝孢霉、须毛癣菌、黑曲霉、烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、新生隐球菌、肺囊菌和紫色毛癣菌中的至少一种。
[0022]可选的实施方式中，所述若干标准菌体悬液中各菌体的浓度范围分别独立的为10至109CFU/mL。
[0023]可选的实施方式中，所述方法还包括将获取的待测样本的Ct值带入标准曲线，获取待测样本中对应真菌的菌体数量。
[0024]可选的实施方式中，所述方法还包括将获取判断为存在感染真菌感染的样本的菌落数，根据Ct值和菌落数的对应关系与标准曲线匹配，以判断感染的真菌的类别。
[0025]可选的实施方式中，所述扩增的反应程序为：(1)95℃预变性5min，循环数为1；(2)95℃变性30s，60℃退火延伸1min，循环数为40；在每个循环延伸后收集荧光信号。(3)熔解曲线分析。
[0026]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0027]本专利技术提供的用于检测真菌的引物对以真菌菌体来源的18SrRNA基因为靶点，具有以下优点：特异性较强，仅对于真菌菌体基因组DNA能进行特异性扩增，对无真菌细胞制剂DNA无法进行扩增；检测灵敏度较高，对白色念珠菌、光滑假丝酵母、近平滑假丝酵母、克
柔假丝酵母、都柏林假丝酵母、热带假丝酵母、卡氏枝孢霉、须毛癣菌、黑曲霉、烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、新生隐球菌、肺囊菌和紫色毛癣菌的检测下限均10CFU/mL。由此，本专利技术实现了对可能存在真菌污染的样本的高灵敏度地检测，对比传统的培养法，本专利技术提供的引物对和建立的检测方法具有很高的灵敏度和时效性，为细胞制剂无菌快检领域提供了一种有效的检测方法。
附图说明
[0028]为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0029]图1为本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测真菌的引物对，其特征在于，包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2。2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述正向引物和所述反向引物的工作浓度分别独立的为8～12μM；优选地，所述正向引物和所述反向引物的工作浓度分别独立的为10μM。3.用于检测真菌的试剂或试剂盒，其特征在于，包含权利要求1或2所述的引物对。4.根据权利要求3所述的试剂或试剂盒，其特征在于，还包括PCR扩增酶、缓冲组分、金属离子、盐、荧光染料、表面活性剂、dNTP、阳性对照和阴性对照中的至少一种。5.权利要求1或2所述的引物对，或权利要求3或4所述的试剂或试剂盒在非诊断和治疗目的的检测真菌中的应用，其特征在于，所述真菌包括白色念珠菌、光滑假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌、都柏林假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、卡氏枝孢霉、须毛癣菌、黑曲霉、烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、新生隐球菌、肺囊菌和紫色毛癣菌中的至少一种。6.非诊断和治疗目的的检测真菌的方法，其特征在于，包括使用权利要求1或2所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘欣，张强，潘若浪，巫飞飞，戴玲华，
申请(专利权)人：杭州易文赛生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：