外泌体的制备方法和培养基及其应用技术

本发明专利技术提供了一种外泌体的制备方法和培养基及其应用，涉及外泌体制备的技术领域。该制备方法包括采用丝裂霉素C处理分泌外泌体的细胞。该制备方法可以实现在不改变细胞的代次的情况下，多次获得细胞的外泌体，从而提高了外泌体的产量。缓解了现有技术中存在的，在制备外泌体时，每个代次内仅能收集一次外泌体导致的产量低的技术问题。致的产量低的技术问题。致的产量低的技术问题。

【技术实现步骤摘要】
外泌体的制备方法和培养基及其应用


[0001]本专利技术涉及外泌体制备
，尤其是涉及一种外泌体的制备方法和培养基及其应用。

技术介绍

[0002]外泌体是一类由细胞分泌直径在30nm～150nm之间的，具有双层脂膜的微小囊泡。其包含原细胞的特异蛋白、miRNA等。目前，对于外泌体，尤其是来自间充质干细胞的外泌体，已有文献报道其具有修复器官，调节免疫功能的作用。
[0003]目前提取干细胞外泌体多采用在干细胞融合度达到80％～90％后，收集培养基上清，再采用合适的方法进行制备成干细胞外泌体制剂的方式，但这种方法在每个代次内仅能完成一次外泌体收集。而干细胞其本身临床使用时，对代次有严格规定，这大大限制了外泌体的产量。因此，如何改进外泌体的制备方法是目前有待解决的问题。
[0004]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0005]本专利技术的第一目的在于提供一种外泌体的制备方法，以缓解现有技术中存在的，在制备外泌体时，每个代次内仅能收集一次外泌体导致的产量低的问题。
[0006]本专利技术的第二目的在于提供一种促进细胞分泌外泌体的培养基。
[0007]本专利技术的第三目的在于提供一种上述外泌体的制备方法，或上述促进细胞分泌外泌体的培养基的应用。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术特采用如下技术方案：
[0009]根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种外泌体的制备方法，包括采用丝裂霉素C处理分泌外泌体的细胞。
[0010]优选地，所述细胞包括干细胞；
[0011]优选地，所述细胞包括间充质干细胞。
[0012]优选地，所述制备方法包括：首次收集外泌体后，采用含有丝裂霉素C的培养基培养细胞，更换普通培养基后继续培养细胞并再次收集外泌体。
[0013]优选地，在细胞达到80～90％融合度时，首次收集外泌体；
[0014]优选地，在细胞达到90％融合度时，首次收集外泌体。
[0015]优选地，培养基中丝裂霉素C的浓度至少为0.5μg/ml；
[0016]优选地，培养基中丝裂霉素C的浓度为0.5～5μg/ml。
[0017]优选地，采用含有丝裂霉素C的培养基培养细胞0.5～3h后更换为普通培养基继续培养；
[0018]优选地，采用含有丝裂霉素C的培养基培养细胞2h后更换为普通培养基继续培养。
[0019]优选地，所述再次收集外泌体的次数为1～3次；
[0020]优选地，收集外泌体的间隔时间为18～36h；
[0021]优选地，收集外泌体的间隔时间为24h，共收集3次。
[0022]优选地，所述收集外泌体包括采用超速离心的方法收集细胞培养基上清中的外泌体；
[0023]优选地，过滤细胞培养基上清，浓缩后再采用超速离心的方法分离细胞培养基上清中的外泌体；
[0024]优选地，超速离心细胞培养基上清，复溶沉淀后再次超速离心，收集外泌体；
[0025]优选地，超速离心的条件为100,000g转速，离心1h。
[0026]根据本专利技术的另一个方面，本专利技术还提供了一种促进细胞分泌外泌体的培养基，所述培养基中含有工作浓度为0.5～5μg/ml的丝裂霉素C；
[0027]优选地，所述培养基包括间充质干细胞培养基和的丝裂霉素C。
[0028]根据本专利技术的另一个方面，本专利技术还提供了一种上述外泌体的制备方法，或上述促进细胞分泌外泌体的培养基在制备药物中的应用。
[0029]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0030]本专利技术提供了一种外泌体的制备方法，该制备方法包括采用丝裂霉素C处理分泌外泌体的细胞。经丝裂霉素C处理的细胞，能够持续的分泌较高量的外泌体，在收集一次外泌体后，继续培养细胞，仍然可以从细胞培养基上清中分离到较高含量的外泌体。因此本专利技术提供的制备方法可以实现在不改变细胞的代次的情况下，多次获得细胞的外泌体，从而提高了外泌体的产量。本专利技术通过实验发现，采用合适浓度的丝裂霉素C处理细胞后，在一代次中多次收集外泌体，外泌体总产量可达单次收集量的约两倍，可见本专利技术提供的外泌体的制备方法，显著的提高了外泌体的产量，进而为以外泌体为主要或辅助活性成分的药物提供了更多的制备原料，有助于和外泌体相关的药物的研发。
附图说明
[0031]为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0032]图1为经丝裂霉素C处理的和未经丝裂霉素C处理的间充质干细胞每次收集上清中的总蛋白浓度的对比；
[0033]图2为经丝裂霉素C处理后，多次收集上清中的总蛋白浓度和首次收集上清中的总蛋白浓度对比；
[0034]图3为分别采用0.5μg/ml和5μg/ml的丝裂霉素C处理后，制备得到的外泌体的总蛋白浓度。
具体实施方式
[0035]下面将结合实施例对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0036]需要说明的是：
[0037]本专利技术中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方法可以相互组合形成新的技术方案；本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案；所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案。
[0038]本专利技术中，除非有其他说明，数值范围“a～b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示；本专利技术所公开的“范围”以下限和上限的形式，可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。
[0039]除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本专利技术中。
[0040]丝裂霉素C是从头状链霉菌培养基中分离提取的一种广谱抗肿瘤抗生素，对多种癌症有抗癌作用，其原理是使细胞的DNA解聚，同时阻碍DNA的复制，从而抑制细胞分裂。丝裂霉素C是一种细胞周期非特异性药物，面对细胞周期G1期作用最显著，也对细胞周期S期也起作用。丝裂霉素C临床上目前主要用于胃癌、肺癌、乳腺癌，也用于肝癌、胰腺癌、结直肠癌、食管癌、卵巢癌及癌性腔内积液。也有研究显示丝裂霉素C还可用于预防术后瘢痕黏连和减少瘢痕组织。没有研究显示丝裂霉素C可以用于制备外泌体。
[0041]传统获取干细胞外泌体的方法是在干细胞达到约90％融合度时，收集培养上清，连续培养干细胞会导致干细胞老化，使得外泌体得量下降。因此一个代次的干细胞只能收集一次外泌体。收集一次外泌体后的干细胞即使继续培养，也只能收集到低量的外泌体。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.外泌体的制备方法，其特征在于，包括采用丝裂霉素C处理分泌外泌体的细胞。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述细胞包括干细胞；优选地，所述细胞包括间充质干细胞。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：首次收集外泌体后，采用含有丝裂霉素C的培养基培养细胞，更换普通培养基后继续培养细胞并再次收集外泌体。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在细胞达到80～90％融合度时，首次收集外泌体；优选地，在细胞达到90％融合度时，首次收集外泌体。5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，培养基中丝裂霉素C的浓度至少为0.5μg/ml；优选地，培养基中丝裂霉素C的浓度为0.5～5μg/ml。6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，采用含有丝裂霉素C的培养基培养细胞0.5～3h后更换为普通培养基继续培养；优选地，采用含有丝裂霉素C的培养基培养细胞2h后更换为普通培养基继续培养。7.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘若浪，张强，巫飞飞，戴唯悠，戴玲华，
申请(专利权)人：杭州易文赛生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：