一种间充质干细胞来源的外泌体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了转染miR

【技术实现步骤摘要】
一种间充质干细胞来源的外泌体及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及间充质干细胞来源的外泌体、外泌体的制备方法及其在制备治疗非小细胞肺癌药物或制剂中的用途，具体是用负载miR
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3p的间充质干细胞产生的外泌体在非小细胞肺癌治疗中的应用。

技术介绍

[0002]肺癌是最高发的肿瘤之一，也是全球死亡率最高的肿瘤。肺癌可以分为非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌，其中NSCLC占80％以上。目前NSCLC的治疗手段包括手术切除、化疗、靶向治疗和免疫治疗，在多种治疗手段下，非小细胞肺癌死亡率仍居高不下，患者5年生存率仅约15％。因此，急需开发新的有效的治疗手段。
[0003]间充质干细胞(MSCs)是一种存在于脐带、骨髓、胎盘、脂肪等多种组织的多能干细胞，具有低免疫原性、免疫调节能力和炎症、肿瘤归巢能力，易于在体外分离培养和迅速扩增，这使得MSCs在炎症、免疫和肿瘤相关疾病的细胞治疗领域备受关注。目前已有多个不同组织来源MSCs细胞药物上市，用于移植物抗宿主病(GVHD)、关节炎、脊髓侧索硬化症(ALS)等，此外，尚有1000多个MSCs相关的临床试验处于不同阶段，包括应用于肿瘤治疗。然而，间充质干细胞植入体内后存在恶性转变及致瘤的风险，而且细胞的存储和运输不便，限制了其临床应用。
[0004]值得关注的是，MSCs能够分泌大量的外泌体(exosome)，这些MSCs来源外泌体携带了MSCs的重要信号分子，包括蛋白质、脂质和RNA等，并保持着与亲代MSCs相似的生物学活性，如调节免疫应答、向炎症肿瘤部位归巢等作用。外泌体的直径约50
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200nm，是一种脂质双层结构的小细胞外囊泡(sEVs)。研究显示，外泌体可作为一种天然的药物递送载体，将具有治疗作用的核酸、蛋白质及小分子药物递送至靶细胞。与脂质体等人工载体相比，外泌体具有更高的生物相容性及安全性，可通过与细胞膜融合将药物输送至细胞质中，显著延长药物半衰期，提高易损分子的递送效率。外泌体还可穿过血脑屏障，其作用范围比细胞更加广泛。此外，外泌体便于储存和运输，同时也可避免直接注射MSCs可能产生的临床风险。MSCs来源外泌体与其他细胞来源外泌体相比，如肿瘤细胞来源外泌体，可能因携带PD
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L1等蛋白存在较高的致瘤风险，免疫细胞来源的外泌体可能存在较高的免疫原性高、细胞较难培养，其他细胞如成纤维细胞来源外泌体还可能存在靶向性低、生物活性不足等问题，间充质干细胞来源外泌具有天然的低免疫原性、富含免疫调节因子、易向炎症与肿瘤部位富集和易于培养扩增等优势。因此，MSC细胞来源外泌体极具开发为无细胞非小细胞肺癌治疗药物或载体的潜力。
[0005]我们首次提取了转染miR
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3p片段的MSCs产生的外泌体，应用于小鼠非小细胞肺癌的治疗中，取得了良好的治疗效果。与细胞治疗相比，外泌体具有稳定性好、存储及应用方便的特点。与人工合成的载体相比，外泌体具有生物活性丰富、生物相容性高等特点。与转染阴性对照片段的MSCs来源外泌体(NC
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MSC
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sEVs)相比，转染miR
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3p片段的MSCs来源外泌体(miR143
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MSC
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sEVs)的治疗效果更强。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供一种转染miR
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3p片段的间充质干细胞来源外泌体(miR143
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MSC
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sEVs)、该外泌体的制备方法及其在治疗非小细胞肺癌中的应用。这种外泌体能抑制非小细胞肺癌小鼠肿瘤组织增殖，促进肿瘤组织凋亡，有效抑制小鼠肿瘤生长，且不影响小鼠体重。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]第一方面，本专利技术提供一种间充质干细胞来源的外泌体，所述间充质干细胞来源的外泌体是由转染miR
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3p片段的间充质干细胞分泌得到。
[0009]第二方面，本专利技术提供一种上述间充质干细胞来源的外泌体的制备方法，所述方法为：
[0010]用miR
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3p片段转染细胞融合至40％
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60％的间充质干细胞，转染完成后，更换新鲜培养基进行细胞培养24
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72小时(优选48
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72小时)，所得上清液(含外泌体的细胞培养基)经后处理，得到所述间充质干细胞来源的外泌体。
[0011]本专利技术所述外泌体来源于脐带间充质干细胞，经一定方法提取，可以在
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80℃冰箱中长期保持活性(至少1年)。
[0012]进一步，所述miR
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3p片段的转染终浓度为10～200nmol/L(优选100nmol/L)。
[0013]进一步，所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。
[0014]优选地，所述间充质干细胞为传代3
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6代的人脐带间充质干细胞。
[0015]具体地，所述人脐带间充质干细胞按如下方法分离获得：采集正常足月剖宫产胎儿脐带，剪取近胎盘端20cm左右，置于4℃预冷的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)保存备用，4小时内使用；在超净工作台内，使用4℃预冷的含0.01％青霉素和0.01％链霉素的PBS冲洗，去除残余血液；将所得脐带置于DMEM/F12培养基中，剥离脐动脉与脐静脉，随后将所得脐带剪成2mm3左右的组织碎块，4℃、300g离心10分钟，弃去上清，向所得组织沉淀中加入250U/mL的胶原酶II、100U/mL中性蛋白酶和10U/mL透明质酸酶，37℃振荡消化2
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3小时至基本消化完全，4℃、300g离心10分钟，弃上清；所得一次沉淀用DMEM/F12培养基重悬离心洗涤3次，所得二次沉淀重悬于含10％胎牛血清的DMEM/F12完全培养基中，接种于T25培养瓶，37℃，5％CO2培养箱培养3
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4天后，轻轻晃动培养瓶，更换新鲜的含10％胎牛血清的DMEM/F12完全培养基，待细胞生长融合达80％左右时，用2.5g/L的胰酶溶液消化，传代接种至(10cm)培养皿中，培养得到所述人脐带间充质干细胞，记为第1代，此后每传一次记为1代。再传代2
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5次，即得3
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6代的人脐带间充质干细胞。
[0016]本专利技术还提供一种转染的方法，所述转染的步骤如下：分离培养人脐带间充质干细胞，取3
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6代的人脐带间充质干细胞，接种于(10cm的)培养皿中，加入细胞培养基，待细胞融合至40％
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60％时，加入转染终浓度为10～200nmol/L(优选100nmol/L)的miR
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞来源的外泌体，其特征在于：所述间充质干细胞来源的外泌体是由转染miR
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3p片段的间充质干细胞分泌得到。2.如权利要求1所述的间充质干细胞来源的外泌体的制备方法，其特征在于所述方法为：用miR
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3p片段转染细胞融合至40％
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60％的间充质干细胞，转染完成后，更换新鲜培养基进行细胞培养24
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72小时，所得上清液经后处理，得到所述间充质干细胞来源的外泌体。3.如权利要求2所述的间充质干细胞来源的外泌体的制备方法，其特征在于：所述miR
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3p片段的转染终浓度为10～200nmol/L。4.如权利要求2所述的间充质干细胞来源的外泌体的制备方法，其特征在于：所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。5.如权利要求4所述的间充质干细胞来源的外泌体的制备方法，其特征在于：所述间充质干细胞为传代3
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6代的人脐带间充质干细胞。6.如权利要求5所述的间充质干细胞来源的外泌体的制备方法，其特征在于所述人脐带间充质干细胞按如下方法分离获得：采集正常足月剖宫产胎儿脐带，剪取近胎盘端20cm，置于4℃预冷的无菌磷酸盐缓冲液保存备用，4小时内使用；在超净工作台内，用4℃预冷的含0.01％青霉素和0.01％链霉素的PBS冲洗去除残余血液；将所得脐带置于DMEM/F12培养基中，剥离脐动脉与脐静脉，随后将所得脐带剪成2mm3的组织碎块，4℃、300g离心10分钟，弃去上清，向所得组织沉淀中加入250U/mL的胶原酶II、100U/mL中性蛋白酶和10U/mL透明质酸酶，37℃振荡消化2
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3小时至消化完全，4℃、300g离心10分钟...

【专利技术属性】
技术研发人员：谷盛贤，赵晓寅，张文，吴东梁，周永楠，陈小川，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：