一种牛脱细胞真皮基质微球及其在细胞三维培养中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种牛脱细胞真皮基质微球，它是将牛真皮进行脱细胞处理后，用胃蛋白酶消化为溶液状态，然后使用乳化交联法制备而成。本发明专利技术提供的微球具有较大的表面积和立体的三维结构，易于细胞粘附，能为细胞提供丰富的胞外基质环境，有利于细胞的存活和增殖。试验结果还表明，该微球能提高骨髓间充质干细胞干性相关基因如OCT4和SOX2的表达，促进细胞因子如TGF

【技术实现步骤摘要】
一种牛脱细胞真皮基质微球及其在细胞三维培养中的应用


[0001]本专利技术涉及一种用于细胞三维培养的牛脱细胞真皮基质微球。

技术介绍

[0002]微球可以为细胞提供三维培养的环境，相比于二维培养，三维培养具有许多不同的特征，如形态特征、增殖分化潜能、细胞
‑
细胞与细胞周围基质的相互作用、信号转导等。目前，细胞治疗需要大量的细胞，二维培养所产生的细胞远远不能达到要求，为了克服这一缺点，三维微球培养应运而生。三维微球应有远大于二维培养的表面积，可以大规模扩增细胞。目前，微球一般使用人工合成高分子材料和天然高分子材料，主要有聚乳酸、聚乙二醇、明胶、胶原、葡聚糖和海藻酸盐等。乳化交联法可用于制作微球，乳化交联法制备油包水乳液液滴，将水相溶液加入油相溶液进行搅拌，形成液滴后加入交联剂，是水相溶液固化形成微球。制备的微球的方法极其简单便捷，且能够实现微球的大量生产。
[0003]理想的生物活性材料的性质应与天然组织细胞外基质的结构和生物性质相似。脱细胞基质是通过去除组织或器官中的细胞组分制备的天然材料，保留组织或器官的三维结构和一些天然纤维组分，例如Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、纤维连接蛋白、层粘连蛋白和糖胺聚糖等；脱细胞基质具有良好的生物活性、生物相容性和低免疫原性。目前，人们普遍使用胶原蛋白等材料进行细胞的三维培养，来模拟体内细胞外基质，但胶原蛋白毕竟只是细胞外基质的成分之一，它无法模拟复杂的细胞生长环境。己有的研究中，人们使用动物的皮肤、肝脏、心脏、软骨和小肠等组织器官制备成脱细胞基质。牛皮由于价格便宜、易获取、没有伦理和宗教约束等优势，被广泛用于脱细胞基质的制备。如今，已有多种脱细胞基质用于细胞的培养，但细胞通常只能在脱细胞基质的表面生长，很少有细胞能进入其内部，这使得直接用脱细胞基质培养细胞的有效面积大大减少，限制了脱细胞基质的使用。因此，使用脱细胞基质构建一种新的细胞培养生物材料是十分具有意义的。
[0004]间充质干细胞广泛应用于组织修复与各种疾病的治疗，近年来，有大量研究表明，间充质干细胞的治疗作用主要来自于其归巢作用和旁分泌作用。干性的提高有助于增强间充质干细胞的分化潜能，间充质干细胞分泌的细胞因子可以这些因子可以调节免疫系统，抑制细胞死亡和纤维化，刺激血管形成，并促进组织重塑。间充质干细胞生物活性并非一成不变的，它会随外界环境的影响而改变。
[0005]通过牛脱细胞真皮基质制备的微球，为间充质干细胞提供天然的体内细胞外基质三维环境，提高间充质干细胞分泌功能和干性，提高临床中间充质干细胞的治疗效果。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种用于细胞三维培养的牛脱细胞真皮基质微球。
[0007]一种牛脱细胞真皮基质微球，其制备方法包括以下步骤：
[0008](1)将牛皮去除表皮和脂肪组织后切成牛真皮小块，将牛真皮小块依次加入到碳酸钠溶液、NaCl溶液、SDS溶液中进行搅拌脱细胞处理，用水洗净后得到牛脱细胞真皮基质，
然后将其冻干，粉碎，得到牛脱细胞真皮基质粉末；
[0009](2)将牛脱细胞真皮基质粉末置于含有胃蛋白酶的乙酸溶液中消化24
‑
48h，离心取上清液，用NaOH调节上清液pH至中性，得可溶性牛脱细胞真皮基质溶液；
[0010](3)将乳化剂和矿物油混匀形成油相，将可溶性牛脱细胞真皮基质溶液加入到油相中，搅拌形成乳液，然后向乳液中加入戊二醛使可溶性牛脱细胞真皮基质固化，最后向乳液中加入异丙醇使乳液分层，离心取沉淀，依次用丙酮、异丙醇和超纯水清洗，置于PBS中浸泡过夜，去除PBS后即得到牛脱细胞真皮基质微球。
[0011]优选地，所述碳酸钠溶液的浓度为1
‑
10％，所述NaCl溶液的浓度为0.5
‑
5M，所述SDS溶液的浓度为0.2
‑
2％。
[0012]优选地，所述胃蛋白酶在乙酸溶液中的浓度为0.5
‑
5％。
[0013]优选地，所述乙酸溶液的浓度为0.1
‑
1M。
[0014]优选地，所述乳化剂是span
‑
80。
[0015]优选地，所述矿物油是液体石蜡。
[0016]优选地，所述乳化剂与矿物油的体积比为1：50
‑
100。
[0017]所述的牛脱细胞真皮基质微球应用于细胞三维培养，尤其是间充质干细胞的三维培养，它具有较大的表面积和立体的三维结构，易于细胞粘附，能为细胞提供丰富的胞外基质环境，有利于细胞的存活和增殖。试验结果还表明，本专利技术提供的微球能提高骨髓间充质干细胞干性相关基因如OCT4和SOX2的表达，促进细胞因子如TGF
‑
β、EGF、TSG
‑
6和VEGF的分泌，从而能增强细胞的分化潜能和免疫调节功能，提高其临床应用效果。
[0018]本专利技术还具有安全无毒，细胞相容性好，微球结构稳定，原材料易得，生产成本低等优点，有广阔的应用前景。
[0019]更详细的技术方案参见具体实施例。
附图说明
[0020]图1是实施例中制备的牛脱细胞真皮基质的外观图；
[0021]图2是实施例中制备的牛脱细胞真皮基质溶液的外观图；
[0022]图3是实施例中制备的牛脱细胞真皮基质微球在光学显微镜下的状态图；
[0023]图4是实施例中制备的牛脱细胞真皮基质微球粒径分布图；
[0024]图5是实施例中犬骨髓间充质干细胞在牛脱细胞真皮基质微球上的生长状况；
[0025]图6是实施例中牛脱细胞真皮基质微球细胞毒性检测结果；
[0026]图7是实施例中牛脱细胞真皮基质微球活/死细胞检测结果；
[0027]图8是实施例中犬骨髓间充质干细胞干性基因mRNA相对表达量；
[0028]图9是实施例中犬骨髓间充质干细胞细胞因子ELISA检测结果。
具体实施方式
[0029]下面结合实施例，对本专利技术进行进一步说明。
[0030]实施例1
[0031](1)牛脱细胞真皮基质的制备：
[0032]a：将牛皮去除表皮的脂肪组织后切成约为0.5cm
×
0.5cm
×
0.1cm的牛真皮小块，
将20g牛真皮小块置于500mL 10％(w/w)碳酸钠溶液中用磁力搅拌器在转速200r/min下搅拌2h，用蒸馏水洗净后，放入500ml的1M NaCl溶液中用磁力搅拌器在转速200rpm下搅拌12h，用蒸馏水洗净后置于500mL 1％(w/w)十二烷基磺酸钠(SDS)溶液中，用磁力搅拌器在转速200r/min下搅拌6h，洗净后得到牛脱细胞真皮基质，其外观如图1所示；
[0033]b：使用冻干机将步骤a中得到的牛脱细胞真皮基质冻干48h，使用粉碎机在30000r/min的转速下，将冻干后的牛真皮脱细胞基质打碎成粉末；
[0034](2)牛脱细胞真皮基质溶液的制本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种牛脱细胞真皮基质微球，其特征在于制备方法包括以下步骤：(1)将牛皮去除表皮和脂肪组织后切成牛真皮小块，将牛真皮小块依次加入到碳酸钠溶液、NaCl溶液、SDS溶液中进行搅拌脱细胞处理，用水洗净后得到牛脱细胞真皮基质，然后将其冻干，粉碎，得到牛脱细胞真皮基质粉末；(2)将牛脱细胞真皮基质粉末置于含有胃蛋白酶的乙酸溶液中消化24
‑
48h，离心取上清液，用NaOH调节上清液pH至中性，得可溶性牛脱细胞真皮基质溶液；(3)将乳化剂和矿物油混匀形成油相，将可溶性牛脱细胞真皮基质溶液加入到油相中，搅拌形成乳液，然后向乳液中加入戊二醛使可溶性牛脱细胞真皮基质固化，最后向乳液中加入异丙醇使乳液分层，离心取沉淀，依次用丙酮、异丙醇和超纯水清洗，置于PBS中浸泡过夜，去除PBS后即得到牛脱细胞真皮基质微球。2.如权利要求1所述的牛脱细胞真皮基质微球，其特征在于：所述碳酸钠溶液的浓度为1
‑
10％，所述NaCl溶液的浓度为0.5
‑
5M，所述SDS溶液的浓度为0...

【专利技术属性】
技术研发人员：张利生，邹梓祺，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：