一种制备蜕膜间充质干细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种制备蜕膜间充质干细胞的方法，涉及蜕膜间充质干细胞制备技术领域，包括以下步骤：(1)、采集；(2)、清洗；(3)、分离；(4)、病毒检测；(5)、消化；(6)、培养；(7)、扩增传代；(8)、收集测活；(9)、冻存。该制备蜕膜间充质干细胞的方法在采集母体胎盘前通过采集母体血液并进行传染病毒检测的方式，便于规避生产存在传染病的蜕膜间充质干细胞，通过消化、培养、扩增传代和收集冻存的方式便于大量培养蜕膜间充质干细胞，并且采用台盼蓝染色的方式便于检测沉淀物中存活的间充质干细胞，以便于及时分离除去失活细胞，并且还可以采用细胞快速分析仪检测法检测并确保蜕膜间充质干细胞的细胞质量。细胞质量。

【技术实现步骤摘要】
一种制备蜕膜间充质干细胞的方法


[0001]本专利技术涉及蜕膜间充质干细胞制备
，具体为一种制备蜕膜间充质干细胞的方法。

技术介绍

[0002]蜕膜是指怀孕后的子宫内膜，由于大剂量孕激素的影响发生变化后形成。胎盘蜕膜含有丰富的干细胞，以间充质干细胞数量最多。间充质干细胞(MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点，在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复，起到美容作用。
[0003]现有的制备蜕膜间充质干细胞的方法，在制备的过程中，未设有多次检测步骤，可能存在失误情况导致所制备的蜕膜间充质干细胞含有母体携带的病毒成分，并且制备后的蜕膜间充质干细胞没有对应的检测并分离失活细胞这一步骤，易影响所制备的蜕膜间充质干细胞成品质量，为此，我们提出一种制备蜕膜间充质干细胞的方法。

技术实现思路

[0004]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种制备蜕膜间充质干细胞的方法，解决了上述
技术介绍
中提出的问题。
[0005]为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现，一种制备蜕膜间充质干细胞的方法，所述制备蜕膜间充质干细胞的方法包括以下具体步骤：
[0006](1)、采集
[0007]采集母体血液并进行传染病毒检测，检测合格后取母体正常分娩后的足月胎盘作为原料，采用生理盐水对胎盘蜕膜进行清洗，再将其浸入到1.5倍体积的胎盘保护液中；
[0008](2)、清洗
[0009]48小时内将胎盘转移至无菌实验室，然后取出胎盘并通过D
‑
Hanks溶液对其进行再清洗，清洗过程中去除凝血直至用于清洗的溶液中不含血色；
[0010](3)、分离
[0011]清洗后将其胎盘放置到无菌托盘中，然后采用无菌剪刀分离胎盘底部靠近母体一侧的蜕膜组织，再将蜕膜组织剪碎成1
‑
4mm3的微小组织块；
[0012](4)、病毒检测
[0013]保留少量蜕膜组织块进行留样，再对其进行病毒检测，确保该蜕膜组织不含有病毒，同时对比该蜕膜组织与采集母体的DNA，确保采集无误；
[0014](5)、消化
[0015]采用组合消化酶对蜕膜组织进行消化，消化过程中恒温振荡30
‑
40min，消化结束
后加入无血清培养基终止消化，采用1800
‑
2200r/min的转速离心5
‑
8min，再去除上清液，保留沉淀；
[0016]进一步的，所述制备蜕膜间充质干细胞的方法还包括以下步骤：
[0017](6)、培养
[0018]然后采用生理盐水清洗底部消化后产物，并加入无血清培养基重悬细胞，得到细胞悬液，再将其接入至培养皿中采用无血清培养基于37℃温度下培养蜕膜间充质干细胞。
[0019]进一步的，所述制备蜕膜间充质干细胞的方法还包括以下步骤：
[0020](7)、扩增传代
[0021]待蜕膜间充质干细胞生长至80％密度时，采用PBS缓冲液洗涤干细胞2次，再使用重量百分含量为0.25％的胰蛋白酶消化3
‑
5min，消化后再次终止消化并离心去除上清液，洗涤后重新采用无血清培养基重悬细胞并进行传代种瓶，从而获得经传代的蜕膜间充质干细胞。
[0022]进一步的，所述制备蜕膜间充质干细胞的方法还包括以下步骤：
[0023](8)、收集测活
[0024]对传代后的蜕膜间充质干细胞进行收集，然后进行消化、离心、去除上清液，保留沉淀，然后采用台盼蓝染色的方式检测沉淀物中存活的间充质干细胞，从而检测细胞活率，然后分离除去失活细胞，再采用细胞快速分析仪检测法来利用电子脉冲分析技术自动检测细胞数日、浓度、直径、体积、细胞碎片、细胞团等细胞状态的详细信息，确保蜕膜间充质干细胞的细胞质量；
[0025](9)、冻存
[0026]采用等体积的细胞冻存保护剂悬浮上述步骤检测后的蜕膜间充质干细胞，混合均匀后将细胞分装到对应的冻存管中，并将其设于液氮中低温冷冻保存，即可完成该蜕膜间充质干细胞的制备。
[0027]进一步的，所述步骤(1)、混料的过程中，清洗所用的生理盐水为浓度0.9％生理盐水。
[0028]进一步的，所述步骤(5)、消化的过程中，组合消化酶具体为I型胶原酶、II型胶原酶其中的一种或两种的混合，且组合消化酶的浓度为1
‑
5mg/m。
[0029]进一步的，所述步骤(6)、培养的过程中，采用无血清培养进行培养时，按1ml蜕膜组织块加入10ml无血清培养基的比例添加无血清培养基。
[0030]进一步的，所述步骤(7)、扩增传代的过程中，传代种瓶时接种的密度为1
×
105
‑1×
106/mL。
[0031]进一步的，所述步骤(9)、冻存的过程中，冻存管每管体积为1mL。
[0032]本专利技术提供了一种制备蜕膜间充质干细胞的方法，具备以下有益效果：该制备蜕膜间充质干细胞的方法，在采集母体胎盘前通过采集母体血液并进行传染病毒检测的方式，便于规避生产存在传染病的蜕膜间充质干细胞，清洗过程中采用D
‑
Hanks溶液清洗，D
‑
hanks液是一种平衡盐溶液，主要用于洗涤细胞和组织，也是合成培养基的基础液，能够减少清洗过程中对胎盘蜕膜的伤害，并且清洗过程中去除凝血直至用于清洗的溶液中不含血色方便后续洁净无血迹蜕膜组织的获取，设有检测步骤，能够通过再检测的方式确保该蜕膜组织不含有病毒，同时对比该蜕膜组织与采集母体的DNA，确保采集无误，通过消化、培
养、扩增传代和收集冻存的方式便于大量培养蜕膜间充质干细胞，且细胞培养时采用无血清培养基于37℃温度下培养蜕膜间充质干细胞，同时按1ml蜕膜组织块加入10ml无血清培养基的比例添加无血清培养基，便于蜕膜间充质干细胞的生长培育，并且在收集测活的过程中，采用台盼蓝染色的方式便于检测沉淀物中存活的间充质干细胞，以便于及时分离除去失活细胞，并且还可以采用细胞快速分析仪检测法检测并确保蜕膜间充质干细胞的细胞质量。
具体实施方式
[0033]下面将结合本专利技术的具体实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。
[0034]一种制备蜕膜间充质干细胞的方法，所述制备蜕膜间充质干细胞的方法包括以下具体步骤：
[0035](1)、采集
[0036]采集母体血液并进行传染病毒检测，检测合格后取母体正常分娩后的足月胎盘作为原料，采用生理盐水对胎盘蜕膜进行清洗，再将其浸入到1.5倍体积的胎盘保护液中；
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备蜕膜间充质干细胞的方法，其特征在于，所述制备蜕膜间充质干细胞的方法包括以下具体步骤：(1)、采集采集母体血液并进行传染病毒检测，检测合格后取母体正常分娩后的足月胎盘作为原料，采用生理盐水对胎盘蜕膜进行清洗，再将其浸入到1.5倍体积的胎盘保护液中；(2)、清洗48小时内将胎盘转移至无菌实验室，然后取出胎盘并通过D
‑
Hanks溶液对其进行再清洗，清洗过程中去除凝血直至用于清洗的溶液中不含血色；(3)、分离清洗后将其胎盘放置到无菌托盘中，然后采用无菌剪刀分离胎盘底部靠近母体一侧的蜕膜组织，再将蜕膜组织剪碎成1
‑
4mm3的微小组织块；(4)、病毒检测保留少量蜕膜组织块进行留样，再对其进行病毒检测，确保该蜕膜组织不含有病毒，同时对比该蜕膜组织与采集母体的DNA，确保采集无误；(5)、消化采用组合消化酶对蜕膜组织进行消化，消化过程中恒温振荡30
‑
40min，消化结束后加入无血清培养基终止消化，采用1800
‑
2200r/min的转速离心5
‑
8min，再去除上清液，保留沉淀。2.根据权利要求1所述的一种制备蜕膜间充质干细胞的方法，其特征在于，所述制备蜕膜间充质干细胞的方法还包括以下步骤：(6)、培养然后采用生理盐水清洗底部消化后产物，并加入无血清培养基重悬细胞，得到细胞悬液，再将其接入至培养皿中采用无血清培养基于37℃温度下培养蜕膜间充质干细胞。3.根据权利要求1所述的一种制备蜕膜间充质干细胞的方法，其特征在于，所述制备蜕膜间充质干细胞的方法还包括以下步骤：(7)、扩增传代待蜕膜间充质干细胞生长至80％密度时，采用PBS缓冲液洗涤干细胞2次，再使用重量百分含量为0.25％的胰蛋白酶消化3
‑
5min，消化后再次终止消化并离心去除上清液，洗涤后...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵彬，
申请(专利权)人：赵彬，
类型：发明
国别省市：