一种MANF基因修饰的脐带间充质干细胞制备与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种MANF基因修饰的脐带间充质干细胞制备与应用，涉及滚塑技术领域，包括以下步骤：S1、原始胚胎干细胞的获取；S2、细胞转染；S3、细胞观察；S4、细胞鉴定；S5、细胞储存。该MANF基因修饰的脐带间充质干细胞制备与应用，利用MANF基因载体使得脐带间充质干细胞转染表达为脐带间充质干细胞，该脐带间充质干细胞制备过程中经过传代培养并经由细胞鉴定将无损的细胞留置保存，使得脐带间充质干细胞活性高效用强，由于脐带间充质干细胞源自脐带兼具胚胎干细胞和成体于细胞的遗传和行为特征细胞采集不对采集者造成伤害，同时迁移到新环境下，对环境刺激更敏感适应性，因为脐带间充质干细胞具有较低的免疫，移植后不会引起宿主的免疫防御。主的免疫防御。

【技术实现步骤摘要】
一种MANF基因修饰的脐带间充质干细胞制备与应用


[0001]本专利技术涉及干细胞制备
，具体为一种MANF基因修饰的脐带间充质干细胞制备与应用。

技术介绍

[0002]干细胞是一类具有无限的或者永生的自我更新能力的细胞、能够产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞。多年来对干细胞的定义不断进行修正，并从不同的层面上来进行定义，间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSC)是一类具有自我更新和多向分化潜能的种子细胞，在不同的诱导条件下不仅能够分化形成骨、软骨、脂肪、肌肉等中胚层的细胞，还能跨胚层分化形成外胚层的神经元、神经胶质细胞、皮肤细胞以及内胚层的血管内皮细胞等多种组织细胞。除具有多向分化潜能外，MSC还可分泌多种细胞因子，MSC通过旁分泌的形式分泌EGF、KGF、VEGF、促血管生成素
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1(angiopoietin
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1,Ang
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1)、bFGF、IGF
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1、Wnt1/3A/5A、HGF、PDGF
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BB和EPO等众所周知能促进血管生成、促进组织细胞生物合成及能量代谢的细胞活性物质，其还可加强创面愈合。另外，这些因子可对调节表皮及上皮细胞生长、分化增殖、促进毛细血管生长、改善生长微环境、保持细胞活性等方面起着重要作用。文献报道，极微量的EGF、FGF即能强烈促进皮肤细胞的分裂和生长，从而达到促进人皮肤的新陈代谢、促进再生修复、减缓皮肤衰老，使皮肤重新恢复弹性和光泽。
[0003]目前，打干细胞针已经受到越来越多人的青睐，因为是通过输注特定的多种细胞的形式来激活人体自身的“自愈”功能。干细胞技术近年来发展迅速，因其在疾病治疗、组织修复、抗衰美容等多方面极具发展潜力和临床应用价值，而成为生命科学领域的重要方向之一，吸引了全球范围的广泛关注。
[0004]现有的MANF基因修饰的脐带间充质干细胞制备常常因为干细胞在体外培养容易自然失去干细胞的基本特性，同时还需要维持细胞干性，为此，我们提出一种MANF基因修饰的脐带间充质干细胞制备与应用。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种MANF基因修饰的脐带间充质干细胞制备与应用，解决了上述
技术介绍
中提出的现有的MANF基因修饰的脐带间充质干细胞制备常常因为干细胞在体外培养容易自然失去干细胞的基本特性，同时还需要维持细胞干性的问题。
[0006]为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现、一种MANF基因修饰的脐带间充质干细胞制备与应用，包括以下步骤：
[0007]S1、原始胚胎干细胞的获取
[0008]首先取得足月产胎儿脐带组织，接着将脐带组织剪碎成1mm3左右的组织块，并将组织块接种于培养皿中加入培养液，待组织块贴壁后再补充培养液继续培养，其中的干细胞可沿组织块周围长出，然后去除组织块并进行传代扩增获得大量干细胞，使得同一组织
块可进行反复培育，用酶原梯度法分离并收集细胞将细胞接种在培养皿中；
[0009]S2、细胞转染
[0010]构建MANF基因载体，将MANF基因载体用PBS缓冲液10％铺在S1步骤中取得的细胞中，使得细胞在培养皿中进行细胞转染；
[0011]S3、细胞观察
[0012]接着将培养皿中取1ml细胞液，加入1ml混合液体，10h后去除复合物的培养基，加入培养液，待48h后，经过滤膜过滤即可等得到含有病毒的上清液，完成慢病毒的包装利用病毒感染干细胞，并利用荧光显微镜观察干细胞的转染效果继续传代培养，经过转染的脐带间充质干细胞即可得到MANF基因修饰的脐带间充质干细胞；
[0013]S4、细胞鉴定
[0014]利用显微镜用荧光对细胞的生长、表型、核型、细胞周期以及分化潜能进行分析鉴定，将细胞中活性强的细胞单独放置在培养皿中；
[0015]S5、细胞储存
[0016]将S4步骤中得到的细胞置于培养液中，并对细胞进行降温，最后细胞置于
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196℃的液氮中保存。
[0017]进一步的，所述在步骤S1原始胚胎干细胞的获取过程中用胰酶提取足月产胎儿脐带组织中充质干细胞悬液离心10min，弃上清液。
[0018]进一步的，所述在步骤S2细胞转染过程中MANF基因载体为慢病毒载体。
[0019]进一步的，所述在步骤细S3细胞观察过程中为了防止细菌污染按细胞培养体系要求在培养皿中添加双抗；
[0020]进一步的，所述在步骤细S3细胞观察过程中1ml混合液体由胎牛血清(FBS)、非必需氨基酸、β
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巯基乙醇、白血病抑制因子(LIF)、干细胞因子(SCF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)构成，其中白血病抑制因子(LIF)具有抑制干细胞分化的功能。
[0021]本专利技术提供了一种MANF基因修饰的脐带间充质干细胞制备与应用，具备以下有益效果：该MANF基因修饰的脐带间充质干细胞制备与应用，利用MANF基因载体使得脐带间充质干细胞转染表达为脐带间充质干细胞，该脐带间充质干细胞制备过程中经过传代培养并经由细胞鉴定将无损的细胞留置保存，使得脐带间充质干细胞活性高效用强，由于脐带间充质干细胞源自脐带兼具胚胎干细胞和成体于细胞的遗传和行为特征细胞采集不对采集者造成伤害，同时迁移到新环境下，对环境刺激更敏感适应性，因为脐带间充质干细胞具有较低的免疫，移植后不会引起宿主的免疫防御，以脐带间充质干细胞为基准将其应用于美容行业，可以明显改善肤质、淡斑祛皱、恢复皮肤弹，增强免疫调节代谢。
具体实施方式
[0022]一种MANF基因修饰的脐带间充质干细胞制备与应用，包括以下步骤：
[0023]S1、原始胚胎干细胞的获取
[0024]首先取得足月产胎儿脐带组织，接着将脐带组织剪碎成1mm3左右的组织块，并将组织块接种于培养皿中加入培养液，待组织块贴壁后再补充培养液继续培养，其中的干细胞可沿组织块周围长出，然后去除组织块并进行传代扩增获得大量干细胞，使得同一组织块可进行反复培育，用酶原梯度法分离并收集细胞将细胞接种在培养皿中；
[0025]S2、细胞转染
[0026]构建MANF基因载体，将MANF基因载体用PBS缓冲液10％铺在S1步骤中取得的细胞中，使得细胞在培养皿中进行细胞转染；
[0027]在步骤S2细胞转染过程中MANF基因载体为慢病毒载体；
[0028]S3、细胞观察
[0029]接着将培养皿中取1ml细胞液，加入1ml混合液体，该混合液体由胎牛血清(FBS)、非必需氨基酸、β
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巯基乙醇、白血病抑制因子(LIF)、干细胞因子(SCF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)构成，其中白血病抑制因子(LIF)具有抑制干细胞分化的功能，10h后去除复合物的培养基，加入培养液，待48h后，经过滤膜过滤即可等得到含有病毒的上清液，完成慢病毒的包装利用病毒感染干细胞，并利用荧光显微镜观察干细胞的转染效果继续本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种MANF基因修饰的脐带间充质干细胞制备与应用，其特征在于，包括以下步骤：S1、原始胚胎干细胞的获取首先取得足月产胎儿脐带组织，接着将脐带组织剪碎成1mm3左右的组织块，并将组织块接种于培养皿中加入培养液，待组织块贴壁后再补充培养液继续培养，其中的干细胞可沿组织块周围长出，然后去除组织块并进行传代扩增获得大量干细胞，使得同一组织块可进行反复培育，用酶原梯度法分离并收集细胞将细胞接种在培养皿中；S2、细胞转染构建MANF基因载体，将MANF基因载体用PBS缓冲液10％铺在S1步骤中取得的细胞中，使得细胞在培养皿中进行细胞转染；S3、细胞观察接着将培养皿中取1ml细胞液，加入1ml含有脂质体和质粒的混合物，10h后去除复合物的培养基，加入培养液，待48h后，经过滤膜过滤即可等得到含有病毒的上清液，完成慢病毒的包装利用病毒感染干细胞，并利用荧光显微镜观察干细胞的转染效果继续传代培养，经过转染的脐带间充质干细胞即可得到MANF基因修饰的脐带间充质干细胞；S4、细胞鉴定利用显微镜用荧光对细胞的生长、表型、核型、细胞周期以及分化潜能进行分析鉴定，将细胞中活性强的细胞单独放置在培养皿中；S5、...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵彬，
申请(专利权)人：赵彬，
类型：发明
国别省市：